ГЕНЕТИКА, 2011, том 47, № 2, с. 183-189
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 575.1:579.841.11:579.842.11
НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ГЕНОМА ФАГОВ ВИДА EL Pseudomonas aeruginosa: ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАНТОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИХ ВИРУЛЕНТНОСТЬ
© 2011 г. С. В. Крылов1, 2, Е. А. Плетенева1, М. В. Буркальцева1, О. В. Шабурова1, К. А. Мирошников2, Р. Лавинье3, А. Корнелиссен3, В. Н. Крылов1
1 Федеральное государственное унитарное предприятие Научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 117545;
e-mail: krylov@genetika.ru 2 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва 119997;
e-mail: kmi@ibch.ru
3 Лаборатория генных технологий, Католический университет г. Лёвен, Бельгия; e-mail: Rob.Lavigne@biw.kuleuven.be Поступила в редакцию 19.03.2010 г.
Продолжено изучение явления псевдолизогении у бактерий Pseudomonas aeruginosa, инфицированных phiKZ-подобными фагами вида EL. Проведен анализ группы вновь изолированных vir-мутан-тов фагов вида EL (EL и RU), проявляющих вирулентность (способность лизировать бактерии, зараженные фагом дикого типа) и пониженный уровень опалесценции негативных колоний (НК). Выявление рекомбинантов дикого типа в скрещиваниях vir-мутантов фагов EL и RU подтверждает полигенный контроль этого признака. Делеционный характер мутации у одного из vir-мутантов фага EL, а также высокий уровень генетической нестабильности другого мутанта предполагают возможное участие в мутагенезе мобильного генетического элемента. Возникновение в бактерии псевдо-лизогенного состояния создает условия для горизонтального переноса генов между разными штаммами бактерий. Таким образом, только секвенирования геномов фагов и доказательства отсутствия у них гено-продуктов с токсическим эффектом оказывается недостаточным для включения фагов в лечебные смеси. Обязательным условием использования живых фагов является детальное изучение возможных результатов их взаимодействия с бактериальным хозяином.
Бактериофаг phiKZ Pseudomonas aeruginosa обладает рядом уникальных признаков [1—4]. Фаги, филогенетически родственные phiKZ и активные на P. aeruginosa, относятся к нескольким видам (phiKZ, Lin68 и EL), объединенным в род phiKZ-подобных фагов семейства Myoviridae. Сходные фаги обнаружены пока только у псевдомонад различных видов [5—12]. До недавнего времени считалось, что phiKZ-подобные фаги являются вирулентными и, поскольку они обладают широким спектром литической активности, они введены в состав коммерческих лечебных препаратов [5, 6]. Полученные нами впервые результаты позволили предположить, что инфекция phiKZ-подобными фагами может приводить к переходу бактериальной клетки в особое, псевдолизогенное состояние, когда бактерия продолжает деление в течение нескольких суток и образует колонию [7]. Однако это состояние нестабильно. Спустя некоторое время происходит лизис таких колоний с освобождением большого количества фага, что объясняет происхождение общего внешнего признака phiKZ-подобных фагов P. aeruginosa — опалесцен-цию негативных колоний (НК). Обнаружение в клинических изолятах P. aeruginosa phiKZ-подоб-
ных фагов подтверждает возможность возникновения и поддержания псевдолизогенного состояния по этим фагам в природных условиях. Ранее у фага EL был отобран мутант, неспособный вызывать псевдолизогенное состояние и проявляющий доминантность в отношении фага дикого типа, что характерно для вирулентных мутантов обычных умеренных фагов [13]. В данной работе мы описываем свойства новых мутантов фагов вида EL, свидетельствующие в пользу сложного генетического контроля установления и поддержания ими псевдолизогенного состояния, а также в пользу существования фактора, способствующего генетической нестабильности фага.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали штамм Pseudomonas aeruginosa PAO1 и его фагоустойчивые варианты, отобранные ранее [14], а также клинические изо-ляты P. aeruginosa из разных ожоговых центров (Германия, Бельгия, Россия).
Бактериофаги дикого типа рода phiKZ-подоб-ных фагов (phiKZ, Lin68, EL), фаг Che21/5, родственный фагам EL и RU, ELvir и сходные по фе-
ELvirlO ELw
ELvirlOm
ELw
EL15
Рис. 1. Определение доминирования мутантов фага EL по установлению псевдолизогенного состояния на газоне бактерий P. aeruginosa РАО1. Вертикальной полоской сделан посев фага дикого типа (ELw). Горизонтальными полосками посеяны vir-мутанты: ELvirlO доминирует, лизируя псевдолизогенные бактерии; EL15 и ELvirlOm практически не препятствуют установлению псевдолизогенного состояния.
нотипу НК мутанты фагов вида EL (RU и Che21/5) [13]. При сравнении фагоустойчивости бактериальных мутантов использовали разные фаги рода phiKZ и другие фаги, в том числе D3, 297, PMG1, LO, D3112cts, B3cts, B39, TL, 1/1, Yu9, PB1, ф44, ОФ, G101, в отношении которых ранее были отобраны устойчивые мутанты P. aeruginosa [14].
Для выращивания бактерий использовали ага-ризованную среду LB [15].
Фаги получали методом сливного лизиса [16].
Для очистки и концентрации фагов проводили центрифугирование в градиенте CsCl [17]. Тест на доминантность/рецессивность — как в работе [13].
Выделение ДНК фагов проводили как стандартным методом [17], так и по методу, предложенному д-ром Чжидун Чэнь (J. Chen) с небольшими модификациями (zchen@aquaplasmid.com, www.aquaplasmid.com). Этот последний метод позволяет избежать необходимости очистки фага центрифугированием в градиенте хлористого цезия и применения фенола.
Обработка рестрикционными эндонуклеаза-ми, электрофорез в агарозном геле — как в [17].
Секвенирование последовательности фрагмента ДНК фага ELvir1, как в [9].
Скрещивания vir-мутантов разных фагов вида EL (ELvir11 х RUvir1): фаги смешивали в равном титре и каплю смеси наносили на газон бактерий PAO1. После ночной инкубации при 37°C материал из пятна лизиса высевали на чашки Петри (с плотностью около 1000 НК на чашку). После 2-суточной инкубации при 37°C можно легко обнаружить опалесцирующие НК рекомбинантов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Фенотипические различия вновь выделенных мутантов фагов вида EL
Выделенные мутанты отличаются по степени опалесценции НК и по вирулентности, которая определяется как способность лизировать клетки, инфицированные фагом дикого типа [13]. Степень вирулентности оценивали по исчезновению опалесценции в зоне пересечения роста фага дикого типа и мутантного фага (рис. 1). По фенотипу вновь выделенные мутанты можно отнести к нескольким группам:
1) мутанты, полностью утратившие опалес-ценцию НК (как ELvir5, ELvirll и ряд других). Все они проявляют свойства типичных вирулентных мутантов умеренных фагов;
2) мутанты с частично сохранившейся опалес-ценцией НК, проявляющие вирулентность (пример — ELvir2, ELvirlO). У одного из таких мутантов (ELvirlO) был выделен вторичный мутант, ELvirlOm, с полной утратой опалесценции и утратой вирулентности;
3) мутанты с полной утратой опалесценции, степень вирулентности которых незначительно варьирует от опыта к опыту (например, ELvir4, ELvir8). В некоторых случаях они ведут себя как мутанты первой группы, в других — проявляют сходство с вторичным мутантом ELvirlOm;
4) мутант ELl5 обладает слабой опалесценци-ей и слабо выраженной вирулентностью. Его отличие от остальных мутантов и фага дикого типа — нестабильность. Периодически в рассевах единичных НК этого мутанта после 2—3 сут инкубации можно легко обнаружить (рис. 2) варианты с разным фенотипом.
Таким образом, корреляция степени вирулентности и уровня опалесценции НК у мутантов наблюдается не всегда.
Рестрикционный и генетический анализ мутантов фагов вида EL
Для дальнейшей дифференциации мутантов проводили рестрикционный анализ их ДНК. На рис. 3 приведены рестрикционные профили ДНК фага дикого типа EL и ряда мутантов после обработки ферментом Sali. Как можно видеть, отличие от фага дикого типа в этом опыте обнаруживают только мутанты второй группы (ELvir2, ELvirlO), у которых один из верхних Sali фрагментов с координатами на кольцевой карте 2O629l—73O5 пн (содержит открытые рамки считывания l94—2Ol и l—8) [9] несет небольшую де-лецию. Чтобы выяснить, идентичны ли сайты, в которых возникли мутации у фагов, неразличи-
Рис. 2. Нестабильность морфологии НК потомства мутанта EL15 на газоне бактерий P. aeruginosa РАО1 после 3-суточной инкубации.
мых по результатам рестрикции ДНК, мы провели их скрещивания. Мутант ELvir5, проявляющий полное отсутствие опалесценции и полную доминантность над фагом дикого типа, скрещивали с группой независимо отобранных феноти-пически сходных мутантов. В потомстве оценивали присутствие фагов, образующих НК с признаком фага дикого типа (с полной опалесценцией). В трех из пяти поставленных скрещиваний были обнаружены единичные рекомбинанты дикого типа (не более 3—5 среди нескольких тысяч НК фагов потомства). Ввиду малой выборки количественно оценивать эти результаты нельзя, однако можно сделать вывод, что мутации, определяющие сходный фенотипический эффект у разных фагов, находятся в разных сайтах, но, скорее всего, в едином кластере (судя по низкой частоте реком-бинантов). Кроме того, были поставлены скрещивания между вирулентными мутантами разных фагов вида EL: ELvir11 и Ruvir1. Оба скрещиваемых мутанта полностью утратили опалесценцию и проявляли перекрестную вирулентность в отношении обоих фагов дикого типа, что свидетельствует о "гомоиммунности" этих фагов. В рассеве материала из опыта по скрещиванию были отобраны НК с высоким уровнем опалесценции, характерным для фагов дикого типа. Их доля была в несколько раз больше, чем в описанных выше скрещиваниях мутантов фага EL. На рис. 4 приведены результаты переваривания ДНК нескольких гибридов EL—RU ферментом Sali. Скрещивае-
Рис. 3. Переваривание ДНК фага ELw и его мутантов эндонуклеазой Sali: 1 — X Hindlii; 2 — ДНК фага ELw, дикий тип; 3 — ДНК мутанта ELvir2; 4 — ДНК мутанта ELvirlO; 5 — ДНК мутанта ELvir5.
мые мутанты не отличаются по рестрикционному профилю от исходных фагов дикого типа. В то же время все случайно отобранные гибриды отличаются как между собой, так и от родительск
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.