НЕЙРОХИМИЯ, 2010, том 27, № 2, с. 130-137
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.821+577.352
неирогенез и апоптоз в зрелом мозге при формировании и упрочении долговременной памяти
© 2010 г. В. В. Шерстнев*, В. В. Юрасов, З. И. Сторожева, М. А. Грудень, А. Т. Прошин
Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт нормальной физиологии
им. П.К. Анохина, Москва
В коре мозга, гиппокампе и мозжечке взрослых крыс определяли содержание маркера клеточной пролиферации — 5 бром-2 дезоксиуридина (ВгВИ) в нативной и фрагментированной ДНК (показатели неонейрогенеза и неоапоптоза), а также маркера апоптоза — межнуклеосомальной фрагментации ДНК через 24 ч, 14 и 30 дней после системного введения ВгВИ, совпадавшего с началом 4-х дневного обучения в лабиринте Морриса. Обнаружено, что физические нагрузки и эмоциональное состояние, связанные с плаванием крыс в лабиринте, вызывают выраженное увеличение (в 2 и более раз) показателей неонейрогенеза, неоапоптоза и апоптоза во всех изученных церебральных структурах. Начальный этап формирования долговременной памяти инициирует значимое возрастание активности апоптоза в гиппокампе и мозжечке. Упрочение долговременной пространственной памяти ассоциировано с достоверными изменениями показателей дифференцировки и программированной гибели вновь образованных 14-30-дневных клеток в префронтальной коре и мозжечке. Выявлены различия в силе и направленности корреляций между пролиферацией, дифференцировкой, гибелью "новых" и "старых" клеток в исследуемых отделах зрелого мозга при физической нагрузке и формировании долговременной памяти.
Ключевые слова: зрелый мозг, глиогенез, апоптоз, БгБИ, фрагментация ДНК, обучение, память.
ВВЕДЕНИЕ
В современных исследованиях проблемы неонейрогенеза и неоапоптоза особое внимание посвящено изучению участия указанных фундаментальных процессов в обеспечении механизмов обучения и памяти. Полагают, что результаты именно этих работ позволят приблизиться к пониманию не только роли нейрогенеза и программированной гибели клеток в зрелом мозге, но и клеточно-молеку-лярных основ когнитивных функций в норме и патологии [1, 6, 8, 10].
Имеющиеся к настоящему времени многочисленные экспериментальные данные о вовлечении неонейрогенеза и неоаптптоза в механизмы обучения и памяти в значительной степени разноплано-вы и противоречивы, что существенно затрудняет их осмысление и интерпретацию. Вместе с тем, необходимо отметить практическое отсутствие сведений о характере и особенностях пролиферации, дифференцировки и апоптоза нейронов и глии в различных церебральных отделах при выработке нового поведения и формировании памяти у взрослых животных, поскольку исследования такого плана, как правило, ограничиваются изучением гиппокампа [8, 10, 12]. При этом в большинстве работ не проводили оценку и анализ структурно-
*Адресат для корреспонденции: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8, тел 8(499)601-21-30, e-mail: sherstnev@inbox.ru
функциональной взаимосвязи между процессами образования, развития, выживаемости и гибели клеток в зрелом мозге [2].
Учитывая изложенное, нами изучено содержание маркера пролиферирующих клеток 5 бром-2 дезоксиуридина (ВгЭи) в нативной и фрагментированной ДНК (показатели неонейрогенеза и неоапоптоза), а также маркера апоптоза — межнуклеосомальной фрагментации ДНК (показатель "суммарного" апоптоза) в мозжечке, гиппокампе и коре головного мозга взрослых крыс через 24 ч, 14 и 30 дней после системного введения ВгЭи, совпадавшего с началом 4-х дневного обучения животных в лабиринте Морриса. Указанные показатели определяли также у "интактных" и "контрольных" крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на крысах — самцах линии Вистар (п = 78) с исходной массой тела 200— 220 г, с соблюдением принципов гуманности, изложенных в Директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС). Животных содержали по 4 особи в клетках со свободным доступом к воде и корму при постоянной температуре 22°С и регулярном световом цикле (включение света в 8.00, выключение в 22.00). Время проведения опытов с 11.00 до 15.00. Были сформированы 3 группы: первая группа —
1234 1234 1234 1234
Динамика формирования пространственной памяти у крыс в лабиринте Морриса. По оси абсцисс — номер пробы. По оси ординат — время достижения платформы (с).
** — р < 0.01 по сравнению с первой пробой в соответствующий день, # — р < 0.05 по сравнению с первой пробой первого дня.
"обучение" включала животных, обучавшихся в водном лабиринте Морриса (п = 27). Вторая группа — "контроль" (п = 27) , и третья — "интактные" крысы (п = 24) , постоянно находившиеся в "домашних" клетках в условиях свободного доступа к воде и пище.
Обучение животных проводили в пространственном водном лабиринте, который представлял собой круглый бассейн диаметром 132 см и высотой 60 см с белой внутренней поверхностью, наполненный водой (23 ± 2°С) до высоты 40 см. Расположение в бассейне прозрачной платформы диаметром 9 см, находившейся на 2 см ниже поверхности воды, так же как и обстановочных стимулов в экспериментальной комнате, было постоянным. Крыс обучали в течение 4-х дней с перерывом между сеансами 24 ч. Во время сеанса животных помещали в воду с 4 разных случайно выбранных точек. После достижения животным платформы его оставляли на ней на 30 с, затем помещали в домашнюю клетку на 30 с. Крыс, не нашедших платформу за 60 с, мягко направляли к ней. В каждой пробе фиксировали время, необходимое для достижения платформы. Животных группы "контроль" подвергали принуди-
тельному плаванию в отсутствие платформы в течение 4-х дней, по четыре пробы ежедневно. Протокол был составлен таким образом, что время плавания в каждой из проб соответствовало времени, проведенному в воде обучавшимся животным, т.е. каждому обучавшемуся животному по времени и паттерну плавания соответствовала одна "контрольная" особь.
"Интактным" животным маркер пролифератив-ной активности клеток — БгЭи вводили внутри-брюшинно 3 раза с интервалом в 60 мин по 50 мг/кг веса в 500 мкл физиологического раствора (суммарная доза — 150 мг/кг). Введение БгЭи крысам из групп "обучение" и "контроль" проводили по вышеописанному протоколу через 1 ч после первого сеанса обучения или первого сеанса "принудительного" плавания в бассейне. Спустя 1, 14 и 30 суток после инъекции БгЭи крыс декапитировали и при +4°С выделяли структуры головного мозга: гиппо-камп, (левый), префронтальную кору (слева) и мозжечок (срединный горизонтальный фрагмент, проходящий через оба полушария и червь). Использование в работе левого гиппокампа и пре-фронтальной коры левого полушария обосновано
полученными ранее данными о функциональной асимметрии процессов апоптоза в зрелом мозге [3].
Выделение и обработку структур мозга, выявление нативной и фрагментированной ДНК проводили согласно протоколам, описанным в наших статьях ранее [2, 5]. Выявление BrDU в образцах на-тивной и фрагментированной ДНК проводили классическим методом Вестерн дот-блота на нитро-целлюлозной мембране с использованием мышиных моноклональных антител к BrDU (Sigma, США), биотинилированных антимышиных антител (Sigma, США), системы конъюгированного со щелочной фосфатазой стрептавидина (Sigma, США) в присутствии хромогена нитротетразолие-вого синего [11, 13]. Количество BrDU, включившегося в ДНК, оценивали по интенсивности окраски дот-блота хромогеном после сканирования. Сканированное видеоизображение анализировали в программе ImageProPlus 3.0 (Media Cybernetics, USA) и выражали в виде интегральной оптической плотности в пересчете на 1 мкг ДНК и 1 мг массы ткани для каждой из исследованных структур мозга (ИОП/мкг ДНК/мг ткани). В образцах, проанализированных методом дот-блота, концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически при 260 нм на спектрофотометре Becman DU-70 (Bec-man, USA).
Статистическую обработку результатов осуществляли в программе STATISTICA 6.0. Для сравнения выборок с нормальным распределением и гомогенными дисперсиями применяли ANOVA. При сомнительной нормальности для сравниваемых выборок использовали непараметрические методы анализа: тест Манна-Уинтни при равномерности дисперсий и Вальда-Вольфовица при их неоднородности. Нормальность распределения оценивали в тесте Шапиро—Уилка, а гомогенность дисперсий — в тесте Левене.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
При анализе процесса обучения обнаружено, что среднее значение времени достижения платформы во втором и всех последующих сеансах было достоверно (р < 0.05—0.01) ниже, чем в первом. Этот факт свидетельствуют, что уже после первого сеанса обучения у животных начинается формирование долговременной пространственной памяти. Вместе с тем, значимое снижение времени достижения платформы в первой пробе по сравнению исходным показателем (первая проба первого сеанса) наблюдалось только к четвертому дню обучения. Таким образом, исходя из среднегрупповых показателей, можно утверждать, что формирование долговременной пространственной памяти начинается уже после первого дня обучения, в то время как для его упрочения необходимо, по меньшей мере, 4 сеанса. Сходные выводы сделаны в работе, показывающей, что показатель среднего за сеанс времени до-
стижения платформы достигает асимптотического уровня к 4-му дню [7].
В ходе работы проводили оценку включения БгЭи как для нативной, так и для фрагментированной ДНК, которые выделяли из одного образца, что позволило характеризовать динамику нейрогенеза и неоапоптоза — программированной гибели вновь образованных клеток зрелого мозга крыс исследованных групп.
Обнаружено, что через сутки после введения БгЭи уровень метки, включенной в во фракцию нативной ДНК ядер клеток, вступивших в деление, (процесс пролиферации) был сходным во всех изученных отделах мозга "интактных" животных. Спустя 14 дней уровень включения БгЭи в нативную ДНК, регистрируемый в мозжечке, достоверно превышал таковые в других исследуемых церебральных структурах (р < 0.05). Количество метки через 30 дней после ее введения было максимальным в гиппокампе — 401 ± 69.3 ИОП/мкг ДНК/мг ткани, значительно превышая соответствующие показатели в коре мозга
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.