ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 2, с. 183-187
=ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 591.1:577.121.7
НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ЯНТАРНОКИСЛОГО ХОЛИНА
______w -t
ПО ТЕСТАМ КОГНИТИВНОЙ ФУНКЦИИ И ХН ЯМР in vívo В МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
© 2007 г. Н. А. Помыткин*, 3. И. Сторожева**, Н. А. Семенова***, А. Т. Прошин**,
В. В. Шерстнев**, С. Д. Варфоломеев****
*Иаучно-технический центр "Тонкие технологии", 125195 Москва, Ленинградское ш., 55А
E-mail: isopure@tkrss.ru **Государственное учреждение ИИИ нормальной физиологии им. П К. Анохина РАМИ,
125009 Москва, Моховая ул., 14/11 E-mail: storozheva_zi@mail.ru ***Институт химической физики им. ИИ. Семенова РАИ, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: semen@chph.ras.ru ****Институт биохимической физики им. И М. Эмануэля РАИ, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: sdvar@enzyme.chem.msu.ru Поступила в редакцию 18.03.2006 г.
Исследован нейропротекторный эффект янтарнокислого холина в условиях хронической ишемии мозга крыс, вызванной лигированием обеих сонных артерий. Использовано два типа оценки нейро-протекторного эффекта: тесты когнитивной функции (рефлекс пассивного избегания, водный лабиринт Морриса) и определение содержания в мозге маркера функционально полноценных нейронов, N-ацетиласпартата методом ХН ЯМР in vivo. Введение янтарнокислого холина достоверно улучшает память и процессы обучения у ишемизированных крыс, а также препятствует индуцированному ишемией снижению уровня церебрального N-ацетиласпартата. Таким образом, янтарнокислый холин проявляет нейропротекторный эффект в условиях ишемического поражения мозга.
Ранее нами было показано методом 31Р ЯМР in vivo, что прекондиционирование янтарнокислым холином (ЯХ) улучшает энергетический метаболизм в головном мозге крыс в условиях тотальной ишемии (Помыткин, Семенова, 2005). Вместе с тем, известно, что при ишемии нарушение энергетического метаболизма является пусковым механизмом развития патологий нервной системы (Гусев, Скворцова, 2001). В этой связи исследование возможного нейропротекторного эффекта ЯХ представляет несомненный теоретический и практический интерес.
Целью настоящей работы является изучение нейропротекторного эффекта ЯХ на модели хронической ишемии головного мозга крыс по двум независимым тестам - по поведению животных и по интенсивности сигнала N-ацетиласпартата (NAA) в головном мозге методом 1Н ЯМР in vivo. Последний метод позволяет прижизненно оценивать содержание нормально функционирующих нейронов в головном мозге, так как NAA обнаруживается в измеримых количествах только в нейронах, а падение его содержания прямо указывает на развивающийся нейродегенеративный процесс (Higuchi et al, 1997; Nonaka et al, 1999; Klijn et al,
2000; Igarashi et al, 2001; Frederick et al, 2004; Szent-kuti et al, 2004).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на половозрелых крысах-самцах линии Вистар возрастом 3 мес. и весом 200-220 г. Крыс разделили на 4 группы. Животным контрольной группы 1 (контроль) лигатуру подводили под сонные артерии, не завязывая (ложная операция). В группах 2-4 у животных индуцировали состояние хронической ишемии головного мозга наложением лигатуры на обе сонные артерии на уровне 4-го шейного позвонка. Операции выполнялись под общим наркозом (40 мг/кг пенто-барбитала).
Препараты вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе. Первую инъекцию делали через 3 ч после операции и далее ежедневно в течение 7 сут по 1 инъекции в сутки. Крысы в группах 1 и 2 получали инъекции физиологического раствора (физ. раствора) по приведенной выше схеме. Крысам в группе 3 вводили ЯХ в дозе 1 мг/кг в 1 мл/кг физ. раствора. Крысам в группе 4 вводили холина хлорид (ХХ) в дозе 1 мг/кг в 1 мл/кг физ. раствора в качестве вещества сравнения.
3
J_I_I_I_I_
3 2 1 0-1
(ppm)
Типичный спектр мозга крысы 1Н ЯМР in vivo: 1 - хо-линсодержащие соединения; 2 - фосфокреатин + креатин; 3 - N-ацетиласпартат; 4 - подкожный жир. Отнесение сигналов проведено согласно (Behar et al., 1983).
Исследование поведения проводили, обучая животных навыку пассивного избегания на 7-9-е сут после операции, а также в водном лабиринте Морриса на 13-14-е сут после операции.
Камера для выработки навыка пассивного избегания состояла из двух одинаковых отсеков размером 25 х 40 х 25 см с полом из металлических прутьев. Отсеки соединялись между собой отверстием 8 х 8 см в общей стенке. Один из отсеков был освещен, другой - затемнен. В ходе выработки рефлекса пассивного избегания животное помещали в освещенный отсек и регистрировали время захода в темную часть камеры (проявление норкового рефлекса). Сразу после того, как все четыре лапы животного оказывались в темной половине камеры, крысе наносили электрокожное раздражение через прутья пола (0.8 мА, 1 с), после чего ее сразу вынимали из камеры и помещали в домашнюю клетку. Через 24 ч после воздействия проводили тестирование выработанного навыка. Крысу вновь помещали в светлый отсек и фиксировали время перехода в темную половину.
Лабиринт Морриса представлял собой круглый бассейн диаметром 120 см с высотой стенок 60 см, выкрашенный изнутри в белый цвет и наполненный водой на высоту 40 см. Бассейн располагался в комнате с большим количеством обстановочных пространственных ориентиров (мебель, окно). Платформа из плексигласа размером 10 х 10 см располагалась в центре одного из секторов на 2 см ниже уровня воды. В воду перед началом опыта добавляли 800 г сухого молока, чтобы исключить возможность непосредственного визуального обнаружения платформы животными. В ходе обучения животных опускали в воду с 6 различных точек и фиксировали время достижения платформы. После того как животное достигало платформы, его оставляли на ней 30 с, а затем на 2 мин возвращали в домашнюю клетку. Через 24 ч после сеанса обучения животных помещали в лабиринт однократно для тестирования долговременной пространственной памяти и регистрировали время достижения платформы.
Уровень NAA у крыс определяли методом !Н ЯМР in vivo на 15-е сут после операции. Для этого животное под наркозом (40 мг/кг пентобарбитала) скальпировали, закрепляли в специальном стерео-тактическом устройстве и помещали в датчик ЯМР, сконструированный для исследований мозга крыс in vivo. Датчик снабжен двумя поверхностными катушками, настроенными на частоты ядер !Н и 31Р (Семенова и др., 1999). Форма катушки обеспечивает локализацию чувствительного объема -области, в которой регистрируется спектр. Для протонов в используемом датчике катушка имеет форму окружности диаметром 14 мм. Радиочастотное поле создается в объеме полусферы с радиусом, равным радиусу витка катушки (Ackerman et al, 1980).
Крысу в датчике располагали так, чтобы катушка лежала на черепе, а центр окружности витка катушки находился непосредственно над центром теменной области мозга жиротного. Датчик помещали в магнит ЯМР- спектрометра АМ WB-400 фирмы Bruker с напряженностью постоянного магнитного поля 9.4 Т и резонансной частотой для ядер !Н 400 МГц. Однородность поля контролировали по полуширине сигнала протонов тканевой воды и оптимизировали шиммировани-ем, добиваясь значений не более 100 Гц. Спектры !Н ЯМР мозга регистрировали согласно методу, предложенному (Gadian et al., 1987), применяя спин-эхо последовательность [1-т-3--т-3-т-1-]-Т-Л++.-Т. Последовательность импульсов 1 3- 3 1-использовалась для подавления сигнала воды; [1 3- 3 1-] = п/2, т = 400 мкс, Т = 68 мкс. Ширина спектрального диапазона составляла 5 кГц, центр спектра устанавливали на сигнале воды. Спектр получали накоплением 64 сканов с релаксационной задержкой 2 с. Сигнал спада свободной индукции для улучшения разрешения умножали последовательно на затухающую экспоненту и трапецеидальную функцию (Gadian et al., 1987). Типичный спектр показан на рисунке.
Амплитуду сигнала NСH3-группы NAA (химический сдвиг 5 = 2.02 ppm) относили к амплитуде суммарного сигнала группы N+(CH3)3 креатина (К) и фосфокреатина (ФК) (5 = 3.03 ppm), используемого как концентрационный внутренний стандарт (Gadian et al., 1986). За 100% принимали среднее значение амплитуды NAA/(ФК + К) для контрольных ложнооперированных животных (группа 1). Достоверность разницы между средними значениями оценивали по двухстороннему критерию Стью-дента.
Результаты тестов когнитивной функции обрабатывали с использованием методов дисперсионного анализа ANOVA/MANOVA и непараметрического критерия Вилкоксона при помощи пакета статистических программ Statistica.
НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ЯНТАРНОКИСЛОГО ХОЛИНА
185
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По данным ХН ЯМР in vivo введение ЯХ животным с хронической ишемией головного мозга обеспечивает достоверный нейропротекторный эффект (табл. 1).
Хроническая ишемия (15 сут), создаваемая перевязкой сонных артерий, вызывает статистически достоверное снижение уровня показателя NAA/(ФK + К) в головном мозге крыс на 21% (группа 2) по сравнению с контрольными ложно-оперированными животными (группа 1). Этот факт указывает на индуцированное хронической ишемией развитие нейродегенеративного процесса в ткани мозга. Полученный результат согласуется с описанным в литературе снижением показателя NAA/(ФK + К) мозге в хроническом периоде ишемии (Юуп ег а1, 2000).
По данным 1Н ЯМР введение ЯХ в течение 7 сут обеспечивает достоверную защиту нейронов мозга в условиях ишемии (группа 3): уровень NAA/(ФK + К) в этой группе достоверно выше, чем у крыс с ишемией (группа 2) и не отличается статистически от уровня NAA/(ФK + К) у контрольных животных (группа 1). Препарат сравнения ХХ (группа 4) не проявляет достоверного ней-ропротекторного эффекта в исследованной дозе (табл. 1).
Результаты поведенческих опытов свидетельствуют, что инъекциии ЯХ в течение 7 сут вызывают достоверное улучшение процессов памяти и обучения у животных при хронической ишемии головного мозга.
Результаты, полученные в модели пассивного избегания, представлены в табл. 2.
В использованной модели время перехода животных в темный отсек камеры является показателем обучения (Нагкапу ег а1, 1998; YanpaПewar ег а1, 2004). Этот показатель достоверно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.