НЕИРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 1-2, с. 57-63
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.821+615.214
НЕЙРОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКЗОРФИНОВ,
ОБЛАДАЮЩИХ РАЗЛИЧНЫМ СРОДСТВОМ К ОПИОИДНЫМ РЕЦЕПТОРАМ ц- И 5-ТИПОВ
© 2008 г. Ю. А. Беляева, В. А. Дубынин*, И. С. Стоволосов, А. А. Каменский
Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Проведено исследование нейротропных эффектов опиоидных пептидов - фрагментов глютена, Ру-биско и цитохрома b. Показано, что обладающие относительной 5-селективностью экзорфин С и рубисколин-5 характеризуются сходным по направленности действием на поведение детенышей белых крыс. Слабо влияя на состояние экспериментальных животных при острых инъекциях, после хронического введения в 1-14-й дни жизни они вызывали снижение тревожности и улучшение обучения в лабиринте с пищевым подкреплением. Последствия применения цитохрофина-4 были наиболее близки к действию Р-казоморфина-5 - короткого ц-селективного фрагмента Р-казеина. Оба эти пептида оказывали анксиолитическое влияние при острых инъекциях; после хронического введения их эффекты быстро угасали по мере созревания мозга детенышей.
Ключевые слова: экзорфины, глютен, Рубиско, казеины, опиоидные рецепторы, новорожденные, поведение, тревожность, обучение.
Экзорфины представляют собой относительно короткие эндорфино-подобные фрагменты пищевых белков. К этой группе опиоидных пептидов относят производные казеинов молока -казоморфины [1], пшеничного глютена - экзорфины А, В, С [2], гемоглобина - геморфины [3, 4], цитохрома Ь - цитохрофины [5], рибулозо-бис-фосфат-карбоксилазы (Рубиско) - рубисколины [6]. Наиболее изученной группой экзорфинов являются фрагменты Р-казеинов молока - Р-казо-морфины (УРРРв...). Они отличаются высокой устойчивостью к ферментативной деградации, а также наибольшим среди пептидов пищевого происхождения сродством к опиоидным рецепторам ц-типа. Показано, что при внутрибрюшин-ном введении в дозах 10-20 мг/кг Р-казоморфины вызывают снижение двигательной активности и анальгезию; в дозах 1-5 мг/кг - уменьшение тревожности, улучшение обучения с положительным подкреплением и ухудшение обучения с отрицательным подкреплением [7]. В сериях с хроническим введением Р-казоморфинов детенышам крыс в 1-14-й дни постнатального развития (доза 1 мг/кг) зарегистрированы в целом аналогичные эффекты [8]. У животных опытных групп наблюдалось снижение тревожности, рост исследовательской активности, ускорение выработки пи-щедобывательных навыков.
В сравнении с Р-казоморфинами, нейротроп-ные эффекты других представителей экзорфи-
* Адресат для корреспонденции: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра физиологии человека и животных, e-mail: dva-msu@yandex.ru
нов изучены очень слабо. В частности, проблема их влияния на ЦНС и поведение детенышей млекопитающих остается практически не исследованной. Между тем она весьма актуальна, что обусловлено способностью компонентов питания, получаемого новорожденными, воздействовать на созревание и становление функций их мозга. В данной работе впервые проанализированы поведенческие эффекты острого и хронического введения детенышам белых крыс экзорфи-на С, рубисколина-5 и цитохрофина-4. Доза пептидов, использованная в опытах (5 мг/кг), была выбрана на основе наших предыдущих исследований [9]. Практическая значимость представленной работы определяется важностью оценки физиологической активности белковых фрагментов, образующихся при переваривании заменителей материнского молока.
МЕТОДИКА
Исследования проводились на беспородных белых крысах, выращенных в виварии кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. День родов принимали за нулевой день их жизни. Крыс содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и пище по одному выводку в клетке. Каждый выводок разделяли на равные по величине опытную и контрольную группы; число самцов и самок в группах также было примерно одинаковым. Детенышам опытных групп внутрибрюшинно вводили пептиды в водном растворе (5 мл/кг, 1 мл/кг); кон-
трольных групп - эквивалентные объемы растворителя. Острое введение препарата подразумевало внутрибрюшинную инъекцию в день эксперимента за 10 мин до тестирования животного, хроническое - внутрибрюшинную инъекцию в 114-й дни постнатального развития детенышей (1 раз в сутки). Использованные в экспериментах экзорфин С (УРКЬ), рубисколин-5 (УРЬБЬ) и ци-тохрофин-4 (УРБТ) были синтезированы под руководством Ж.Д. Беспаловой.
Уровень тревожности и исследовательской активности детенышей оценивали в тесте "открытое поле" (возраст 21 день и 35 дней). Обучение с положительным пищевым подкреплением проводили с 36 по 41-й дни жизни. Средняя величина как опытных, так и контрольных групп составляла в случае острого введения 20 животных; в случае хронического введения - 40 животных.
Использованное нами "открытое поле" представляет собой круглую арену диаметром 80 см с полом, расчерченным на сегменты восемью диаметрами и двумя концентрическими окружностями, находящимися на равном расстоянии друг от друга. Арену окружает стенка высотой 40 см. При тестировании животное помещали в центр арены и затем поминутно регистрировали следующие показатели: горизонтальную двигательную активность (пробег; по числу пройденных сегментов), вертикальную двигательную активность (количество стоек), груминг, отходы от стенки арены и выходы в ее центр (по числу радиальных перемещений с пересечением внешней и внутренней окружностей, соответственно). Процедура тестирования была основана на методе [10], предполагающем оценку поведения в течение 5 мин. При этом в 1-3 мин был включен яркий свет; затем на 1 мин его заменяли на красную лампу, после чего восстанавливали исходный уровень освещенности.
Выработку условной пищедобывательной реакции на место проводили в лабиринте, представляющем собой квадратную камеру (60 х 60 х 25 см), разделенную пятью прозрачными перегородками на шесть коридоров [11]. В каждой перегородке имеется прямоугольное отверстие (в разных перегородках - в разных местах). За сутки до начала обучения проводилась адаптация крыс к условиям эксперимента. В последующие 4 дня каждое животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3 мин. В качестве подкрепления использовали хлебные шарики, которые располагали в самом удаленном от экспериментатора углу камеры.
В процессе обучения крысу переносили в стартовый отсек (ближайший к экспериментатору коридор), после чего регистрировали время реакции (латентный период взятия подкрепления),
число выполненных реакций (число случаев, когда животное находило подкрепление в течение 3 мин пребывания в лабиринте), количество ошибок (число отклонений от оптимальной траектории движения, когда крыса после прохода очередного отверстия в перегородке сворачивала в "неверную" сторону), количество возвратов. Также подсчитывалось число стоек и актов груминга. После 4 дней обучения крыс переучивали в течение 2 дней в условиях лабиринта с зеркального повернутыми перегородками. Инъекцию препаратов при этом не проводили.
Для обработки результатов использовали пакет программ Statistica. Вычисляли средние (AM), ошибки средних (SEM), дисперсии и стандартные отклонения (SD) массивов данных. При сравнении средних и форм распределений применялись параметрический критерий Стьюдента и непараметрические критерии (Манна-Уитни, %2, точный Фишера).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Острое и хроническое введение экзорфина С.
Первые опиоидные пептиды пищевого происхождения выделены из гидролизата глютена пшеницы. Они обладали налоксон-зависимой активностью, ослабляли сокращения семявыно-сящего протока мыши, а также ингибировали аденилатциклазу в клетках нейробластомы [12]. Пероральное введение гидролизата глютена увеличивало время прохождения пищи через кишечник и повышало уровень инсулина в плазме крови [13]. Экзорфин Ä5 (GYYPT) при перораль-ном введении (300 мг/кг) оказывает анксиолити-ческое действие и улучшает консолидацию памяти в ходе выработки условной реакции пассивного избегания. Его внутрибрюшинное введение (10 и 100 мг/кг) снимает стресс-вызванную антиноци-цепцию [14]. В наших экспериментах объектом изучения стал опиоидный фрагмент глютена YP-ISL - так называемый экзорфин С. В отличие от ß-казоморфинов для него показана относительная 5-селективность и слабое связывание с опио-идными рецепторами ц-типа [2].
На первом этапе исследований было обнаружено отсутствие различий в поведении контрольных крыс и животных, которым однократно вводился экзорфин С (возраст 21 и 35 дней, тестирование в открытом поле). При обучении и переучивании в лабиринте (возраст 36-41 дней) единственным значимым эффектом, свидетельствующим о некотором улучшении выработки навыка у детенышей опытной группы, оказалось увеличение доли относительно хорошо обучившихся особей во 2-й день эксперимента. В опытной группе почти все крысы (20 из 21) выполнили не менее 3 реакций взятия подкрепления; в кон-
троле таковых оказалось 12 из 20 (р < 0.01 по точному критерию Фишера).
В серии с хроническим введением выявлено несколько большее количество достоверных изменений. В максимально яркой форме они обнаружены в подгруппе самок в возрасте 21 день; направленность изменений можно охарактеризовать как анксиолитическую, приводящую к росту исследовательской активности. На разных минутах тестирования в открытом поле у самок, получивших инъекции экзорфина С, был значимо увеличен уровень пробега (рис. 1а), количество стоек, число отходов от стенки арены и выходов в ее центр. Так, общее число отходов за все 5 мин наблюдений в контроле составило 1.4 ± 0.5; в опытной группе 4.2 ± 1.2 (р < 0.05 по критерию Стью-дента). Пробег и количество стоек, совершенных самцами опытной группы, от контроля не отличались. Более того, число отходов от стенки арены и выходов в ее центр проявили заметную тенденцию к снижению в случае детенышей, получавших инъекции экзорфина С (р = 0.06-0.09).
В возрасте 35 дней при повторном помещении в открытое поле у самок опытной группы обнаружено почти полное исчезновение отличий о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.