УДК 577.112.083:571.27
НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ И ХИМЕРНЫЕ АНТИТЕЛА
к интерферону-у человека
© 2015 г. М. В. Ларина*' *, Т. К. Алиев*, О. Н. Солопова**, Л. П. Позднякова***, С. В. Коробова****, С. А. Якимов*, П. Г. Свешников***, Д. А. Долгих* ****, М. П. Кирпичников* ****
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **МГУим. М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва ***Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Москва ****ФГБУ "ГНЦИнститут Иммунологии " ФМБА России, Москва *****МГУим. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва Поступила в редакцию 12.08.2014. Принята к печати 01.11.2014 г.
Аутоиммунные заболевания — это хронические заболевания, при которых иммунный ответ направлен на собственные антигены организма, что приводит к повреждению тканей и нарушению их нормального функционирования. Нередко эти заболевания приводят к инвалидности и смерти пациентов. На сегодняшний день для направленной терапии аутоиммунных заболеваний успешно применяется ряд моноклональных антител к провоспалительным цитокинам и их рецепторам. Одной из перспективных мишеней для лечения аутоиммунных заболеваний является интерферон-у (IFN-y), цитокин, играющий ключевую роль в дифференцировке ТЫ-клеток, активации макрофагов и воспалении. В работе был получен набор из 5 моноклональных антител (мАТ) к IFN-y человека. Для получения прототипа терапевтического препарата исследованы аффинность полученных антител к IFN-y и их способность к блокированию индуцированной IFN-y активности. На основании полученных данных для химери-зации было выбрано мАТ F1, комплекс которого с IFN-y характеризуется константой диссоциации 1.7 нМ; кроме того, это антитело проявило низкое значение IC90 (8.9 ± 2.0 нМ) при ингибировании индуцируемой IFN-y экспрессии антигена HLA-DR на поверхности клеток линии U937. Был сконструирован бицистронный вектор для продукции Fab-фрагмента химерного антитела F1 chim в клетках E. coli. Полученный рекомбинантный Fab-фрагмент химерного антитела F1 нейтрализует IFN-у-инду-цируемую активность in vitro и его комплекс с IFN-y характеризуется константой диссоциации 1.8 нМ.
Ключевые слова: интерферон-у, терапевтические моноклональные антитела, рекомбинантные антитела.
DOI: 10.7868/S0132342315030057
Аутоиммунные заболевания поражают около 5% населения в мире и характеризуются высокой частотой летальных исходов [1]. Это хронические заболевания неизвестной этиологии, которые обу-
Сокращения: мАТ — моноклональные антитела; FITC — Fluorescein isothiocyanate; HLA-DR — человеческий лейкоцитарный антиген DR (Human Leukocyte Antigen DR); IC90 и IC50 — концентрация 90%-го и 50%-го ингибирования; IDA-сефаро-за — сефароза, активированная иминодиацильными группами; IFN-y — интерферон-у; IPTG — изопропил-Р-!>-тиога-лактопиранозид; SOE-ПЦР — Splicing by Overlap Extension PCR (ПЦР с перекрывающимися областями); PBS — забуфе-ренный физиологический раствор; TMB — 3,3',5,5'-тетраме-тилбензидин; PMSF — фенилметилсульфонилфторид; Th — T-хелперные клетки; Treg — регуляторные T-клетки; TNF — фактор некроза опухолей. # Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-66-38, эл. почта: marya.larina@gmail.com).
словлены комбинацией различных факторов: генетической предрасположенностью, факторами внешней среды и нарушениями работы иммунной системы. Предполагается, что сбой механизмов, контролирующих иммунную толерантность, обусловливает узнавание собственных антигенов аутореактивными лимфоцитами, что приводит к повреждению тканей. Общими чертами различных аутоиммунных заболеваний являются дефекты в активации лимфоцитов и механизмах врожденного иммунитета, постоянная инфильтрация органов, подверженных атаке лейкоцитами и лимфоцитами, повышенная продукция цитокинов и секреция аутоантител [2, 3].
Использование биопрепаратов показало, что блокирование провоспалительных цитокинов, та-
ких, как ТЫБ-а и 1Ь-6, может предотвращать про-грессирование заболевания при ревматоидном артрите и ряде других аутоиммунных заболеваний [3]. Одним из провоспалительных цитокинов, рассматриваемым как перспективная мишень для терапии аутоиммунных заболеваний, является №N-7, один из самых важных медиаторов иммунного ответа и воспаления. Этот цитокин играет ключевую роль в активации макрофагов, воспалении, защите организма от внутриклеточных патогенов, в ТЬ1-от-вете [4]. Наряду с этим ¡БЫ-у выполняет регулятор-ные функции, ограничивая повреждение тканей, связанное с воспалением, и влияет на дифференци-ровку ТЬ- и Тге§-клеток. Для ряда заболеваний показана способность ¡БЫ-у усиливать или подавлять (в зависимости от стадии развития патологического процесса) аутоиммунные процессы и связанные с ними патологии [5].
Эффективным способом селективного подавления биологической активности ¡БЫ-у для терапевтических целей является использование специфичных к нему моноклональных антител (мАТ). Одним из первых примеров использования антител к ¡БЫ-у в терапии стали клинические испытания гуманизированного антитела фонтолизумаб для лечения болезни Крона, которые впоследствии были приостановлены на 2-й фазе ввиду недостаточной эффективности [6]. Вместе с тем было показано, что использование по-ликлональных антител, специфичных к ¡БЫ-у при таких заболеваниях, как псориаз, ревматоидный артрит, витилиго, вторично-прогрессирующий рассеянный склероз, имеет выраженный терапевтический эффект [7].
Моноклональные антитела, полученные с помощью иммунизации животных, чаще всего мышей, обладают высокой иммуногенностью при введении в организм человека, особенно повторном, что приводит к уменьшению времени полувыведения и снижению эффективности лечения, вызывает ряд нежелательных реакций [8, 9]. Кроме того, в организме человека мышиные мАТ, эф-фекторные функции которых реализуются по клеточноопосредованному механизму, не способны проявлять терапевтический эффект [10]. Эти недостатки мышиных мАТ препятствуют их использованию в качестве терапевтических препаратов для человека. Для снижения иммуногенно-сти терапевтических мАТ широко применяются такие подходы, как химеризация и гуманизация (замена последовательностей каркасных участков вариабельных доменов мышиных мАТ на соответствующие последовательности человека) [11]. Другим направлением в разработке терапевтических мАТ является получение полностью человеческих мАТ из комбинаторных библиотек с использованием метода фагового дисплея, или ис-
Таблица 1. Аффинность моноклональных антител к ТБЫ-у и их изотипическая принадлежность
мАТ ^ х 108, М Тяжелая цепь Легкая цепь
0.17 ^01 к
Л4 6.3 ^01 к
Б4 1.3 ^01 к
Л1 3.5 :§02а к
С1 3.9 !е01 к
пользование трансгенных животных (например, использование технологии Хепошоше) [11, 12].
Целью настоящей работы было получение химерных моноклональных антител против ¡БЫ-у человека для создания на их основе терапевтического препарата для лечения воспалительных аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, псориаз и другие.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Использование мышиных мАТ для получения на их основе прототипа терапевтического препарата для человека предполагает выполнение ряда этапов, начиная от иммунизации животных до структурного и физико-химического анализа свойств выбранного антитела. Важным этапом на пути к терапевтическому использованию мышиных мАТ является проведение их химеризации и оценка ее влияния на свойства родительского мАТ.
Для получения гибридом, продуцирующих мАТ к человеческому ¡БЫ-у, использовали клетки мие-ломы 8Р2/0 и лимфоциты мышей линии БЛЬБ/е, иммунизированных комплексом из рекомбинант-ного человеческого ¡БЫ-у и антитела к нему. Для первичной характеристики полученных мАТ было проведено их изотипирование с помощью прямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием диагностических антител против различных субизотипов антител мыши и определение аффинности к ¡БЫ-у человека. Полученные гибридомы продуцировали антитела класса ^О, 4 клона антитела подкласса ¡§01 и один клон подкласса ¡§02а (табл. 1). Образцы антител получали из асцитной жидкости мышей, образовавшейся в результате прививки животным клеток соответствующих гибридом (табл. 1). Значения констант диссоциации комплексов полученных мАТ с ¡БЫ-у находятся в диапазоне от 3.9 х 10-8 до 1.7 х 10-9 М (табл. 1). Сравнение констант диссоциации показывает, что
Рис. 1. Ингибирование индуцированной ГРЫ-у экспрессии антигена НЬА-ВЯ на поверхности клеток и937. (а) — сравнение нейтрализующей активности пяти мАТ против ГРЫ-у при концентрациях ГРЫ-у 5 и 50 нМ. (б) — сравнение нейтрализующей активности мАТ Р1 (1) и мАТ А1 (2) в интервале концентраций от 1.7 до 200 нМ.
из пяти исследуемых мАТ наибольшей аффинностью по отношению к ГРЫ-у человека обладает антитело Р1.
На следующем этапе нейтрализующую биологическую активность антител определяли по их способности ингибировать экспрессию молекул человеческого лейкоцитарного антигена ЭЯ (НЬА-ЭЯ) на поверхности клеток линии и937, индуцируемую ГРЫ-у. Результаты эксперимента показали, что все исследуемые мАТ обладают специфической нейтрализующей активностью по отношению к 1РЫ-у (рис. 1а), при этом два антитела из пяти, Р1 и А1, нейтрализуют человеческий 1РЫ-у с максимальной эффективностью. Исследование нейтрализующей активности антител Р1 и А1 в более широком интервале концентраций, от 1.5 до 200 нМ (рис. 1б), показало, что выбранные антитела характеризуются значениями 1С90 для мАТ Р1 и А1 8.9 ± 2.0 и 13.5 ± 2.4 нМ соответственно.
Результаты определения биологической активности антител в широком интервале концентраций, а также данные о константах диссоциации комплекса антитела с 1РЫ-у позволили выбрать мАТ Р1 для получения на его основе химерного аналога. Химеризация представляет собой замену константных доменов мАТ мыши на соответствующие домены человека, что позволяет снизить иммуноген-ность получаемых антител за счет отсутствия иммунного ответа на Рс-фрагмент антитела мыши.
Как правило, моноклональные антитела, применяемые в терапии человека, представляют собой полноразмерные
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.