БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 9, с. 1431 - 1439
УДК 577.152.1
НИЗКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ Н2О2 АКТИВИРУЮТ СИСТЕМУ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА
© 2015 В.В. Евдокимов1, К.В. Баринова2, В.Б. Туровецкий3, В.И. Муронец2, Е.В. Шмальгаузен2*
1 Институт урологии им. Н.А. Лопаткина, 105425 Москва; факс: +7(499)165-0911, электронная почта: vvevdok@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-3181, электронная почта: shmal@belozersky.msu.ru
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-1115,
электронная почта: vbturovet@rambler.ru
Поступила в редакцию 17.02.15
Исследовано влияние низких концентраций перекиси водорода (10—100 мкМ) на подвижность сперматозоидов и активность сперматозоидного фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ОАРБ8). Показано, что инкубация с 10 и 100 мкМ Н2О2 приводит к увеличению числа сперматозоидов с активной подвижностью соответственно на 20 и 18% и повышению активности на 27 и 20% по сравнению с пробой без добавок. Также обнаружено, что после инкубации с 10 мкМ перекисью водорода содержание восстановленного глутатиона (08Н) в сперматозоидах увеличивается, в среднем, на 50% по сравнению с контролем. Предполагается, что инкубация сперматозоидов с низкими концентрациями перекиси водорода активирует пентозофосфатный путь, что приводит к синтезу МАОРН и восстановлению окисленного глутатиона глу-татион-редуктазой. Вследствие этих процессов в клетке повышается уровень в8Н, который восстанавливает окисленные цистеины активного центра вАРБ8, что приводит к росту активности фермента и увеличению числа подвижных сперматозоидов. Таким образом, увеличение числа подвижных сперматозоидов в присутствии низких концентраций перекиси водорода может служить индикатором нормальной работы клеточной системы антиоксидантной защиты.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, сперматозоиды, активные формы кислорода, антиоксидантная защита.
Одной из важнейших характеристик сперматозоидов, определяющих способность к оплодотворению, является их подвижность. Основной причиной снижения фертильности спермы является токсичное действие активных форм кислорода (АФК) [1—4]. В нашей предыдущей работе было показано, что снижение подвижности сперматозоидов в присутствии перекиси водорода связано с окислением одного из ферментов гликолиза — глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы [5]. Гликолиз необходим для синтеза АТР в клетке, поэтому активность глице-
Принятые сокращения: GAPDS — спермоспецифич-ная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; dN-GAPDS — рекомбинантный белок GAPDS без ^-концевого домена; АФК — активные формы кислорода, G6PD — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; ПФП — пентозофосфатный путь; ATM — сериновая/треониновая протеинкиназа.
* Адресат для корреспонденции.
ральдегид-3-фосфатдегидрогеназы важна для всех энергозависимых процессов, включая разные типы движения. В клетках различных органов и тканей глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназа локализована в цитоплазме, где протекают реакции гликолиза. В сперматозоидах присутствует особый изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ОАРБ8), который отличается от изофермента соматических клеток прежде всего тем, что он прочно связан с фиброзной оболочкой основного отдела жгутика сперматозоида [6—8]. Показано, что ОАРБ8 необходима для движения сперматозоидов: нарушение экспрессии гена ОАРБ8 приводит к серьезным нарушениям подвижности сперматозоидов, блокируя их поступательное движение [9].
Обе изоформы фермента легко окисляются АФК, в том числе перекисью водорода, в результате чего теряют ферментативную активность
[10—12], что приводит к снижению продукции ATP в ходе гликолиза. Ранее мы показали, что в присутствии умеренных и высоких концентраций перекиси водорода (более 0,5 мМ) подвижность сперматозоидов падает пропорционально снижению активности GAPDS [5]. Влияние низких концентраций перекиси водорода в данной работе не рассматривалось, поскольку казалось естественным, что в низкой концентрации перекись водорода будет немедленно нейтрализована антиоксидантной системой клеток, и все эффекты будут слабо выраженными. Однако в литературе появляется все больше данных о том, что именно малые концентрации АФК (до 50 мкМ) могут активировать в сперматозоидах каскады ферментативных реакций, регулирующих процессы капацитации и оплодотворения [13—15].
Таким образом, АФК в малых дозах могут быть частью регуляторного механизма, который обеспечивает ответ клетки на изменение внешних условий. Этот клеточный ответ может затрагивать основные метаболические пути, а также влиять на подвижность сперматозоидов.
Кроме того, раньше мы показали, что мягкое окисление глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назы в мышечных экстрактах низкими концентрациями перекиси водорода приводит к разобщению окисления и фосфорилирования в гликолизе, приводя к ускоренному накоплению лактата за счет снижения продукции ATP [16]. Такие изменения в гликолизе могут приводить к накоплению субстрата для окислительного фос-форилирования (пирувата) и, следовательно, к ускорению окислительного фосфорилирования в клетках. Если предположить, что подобный эффект может наблюдаться в сперматозоидах, то в присутствии низких концентраций Н2О2 может измениться соотношение гликолиза и окислительного фосфорилирования, а, следовательно, характер подвижности сперматозоидов. В представленной работе для проверки указанных выше предположений мы исследовали влияние низких концентраций перекиси водорода на активность глицеральдегид-3-фосфатдегид-рогеназы и на характер подвижности сперматозоидов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. Использовали следующие реактивы: глицин, NAD («MP Biomedicals», США), диэтил-ацеталь глицеральдегид-3-фосфата (бариевая соль), восстановленный глутатион, каталаза из печени быка, ЭДТА («Sigma-Aldrich», США), 5,5'-дитио-бис-нитробензойная кислота («Ferak», Германия), трипсин («Спофа», Чехия).
Исследование влияния перекиси водорода на подвижность сперматозоидов. Исследования проводили на сперматозоидах человека. После разжижения эякулята каждый образец микроскопи-ровали в проходящем свете при увеличении х 400 на микроскопе Amplival (Jena, «Karl Zeiss», Германия). Подвижность сперматозоидов определяли с помощью автоматического спермоанали-затора СА — 500 («Биола», Россия). Эксперименты проводили при температуре 20—22°. Исследовали образцы спермы, содержавшие не менее 40% подвижных клеток. Из полученного образца эякулята отбирали пробы для опыта и контроля. В экспериментальные пробы вносили Н2О2 до конечной концентрации 10 и 100 мкМ. Через 1 ч оценивали изменение подвижности сперматозоидов в контрольной и экспериментальных пробах, после чего во все пробы добавляли по 0,2 мкг (1 ед) каталазы и осаждали сперматозоиды центрифугированием (5 мин, 1500 g). Супернатант удаляли, а в осадке клеток определяли активность GAPDS.
Определение активности GAPDS в сперматозоидах. К осажденным клеткам добавляли равный объем фосфатно-солевого буфера (10 мМ фосфат калия, 0,15 М NaCl, pH 7,5) и разрушали клетки ультразвуком. В полученной суспензии определяли активность GAPDS и концентрацию общего белка. Активность GAPDS определяли с помощью спектрофотометра «Shimadzu» UV-1601 (Япония) при 20°, измеряя нарастание поглощения в реакционной смеси в результате образования NADH (340 нм) в ходе окисления 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА). Реакционная смесь (1 мл) содержала 50 мМ глицин, 50 мМ фосфат калия, pH 9,0, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ NAD, 1 мМ 3-ФГА и 20 мкл суспензии разрушенных сперматозоидов. Удельную активность фермента выражали в мкмоль NADH/мин на 1 мг белка.
Определение белка. Концентрацию белка в исследуемых образцах определяли по методу Брэдфорд [17]. К 1 мл реактива добавляли 1—2 мкл суспензии сперматозоидов и через 1 мин регистрировали поглощение раствора при 595 нм.
Определение концентрации перекиси водорода. Концентрацию Н2О2 определяли спектрофото-метрически при 230 нм, считая коэффициент экстинкции равным 72,7 M-1 см-1.
Определение содержания глутатиона в сперматозоидах. После измерения подвижности сперматозоиды осаждали центрифугированием. Су-пернатант удаляли, а к осадку клеток добавляли 100 мкл буфера (50 мМ фосфат калия, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) и разрушали клетки ультразвуком. В полученной суспензии определяли содержание общего белка по методу Брэдфорд (как описано
выше). Затем суспензию центрифугировали (13 000 g, 10 мин), осадок удаляли, а в экстракте определяли содержание восстановленного глу-татиона (GSH). Для определения GSH белки в экстракте осаждали концентрированной хлорной кислотой, добавляя к 100 мкл экстракта 17 мкл HClO4 (до конечной концентрации 1 мМ), после чего раствор нейтрализовали добавлением 14 мкл насыщенного раствора K2CO3. Выпавший осадок удаляли центрифугированием (13 000 g, 5 мин), а в супернатанте определяли содержание GSH в реакции с 5,5'-дитио-бис-нитробензойной кислотой (ДТНБ). Содержание GSH определяли сразу в нескольких пробах: по 100 мкл пробы вносили в лунки 96-луночного планшета и добавляли 5 мкл 0,01 М раствора ДТНБ. Через 5 мин в лунках определяли поглощение при 400 нм при помощи планшетного фотометра. Калибровочную прямую для определения GSH строили, используя раствор восстановленного глутатиона, концентрацию которого определяли по светопог-лощению при 412 нм, считая в = 13 600 М-1 см-1. Содержание GSH в экстракте рассчитывали на 1 мг общего белка в суспензии разрушенных клеток.
Выделение GAPDS из сперматозоидов для масс-спектрометрического исследования. Для того, чтобы выделить GAPDS из сперматозоидов в растворимой форме, необходимо отщепить Л-кон-цевой фрагмент (~70 аминокислотных остатков), с помощью которого белок прикрепляется к цитоскелету жгутика. Для этого исследуемые образцы сперматозоидов сначала разрушали ультразвуком и центрифугировали. Затем к осадку разрушенных клеток (~50 мкл) добавляли 50 мкг трипсина в 50 мкл фосфатно-солевого буфера, pH 7,5, и инкубировали 15 м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.