БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 5, с. 723 - 734
УДК 577.3
НИЗКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ РАЗОБЩИТЕЛЕЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ
ПРЕДОТВРАЩАЮТ ВОСПАЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВАЦИЮ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ВЫЗВАННУЮ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ
© 2015 В.П. Ромащенко12, Р.А. Зиновкин134, И.И. Галкин1, В.В. Захарова1,2, А.А. Пантелеева1, А.В. Токарчук1,2, К.Г. Лямзаев1,4, О.Ю. Плетюшкина14, Б.В. Черняк14, Е.Н. Попова14*
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; электронная почта: k_popova_ch@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991 Москва
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
биологический факультет, 119991 Москва
4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ Митоинженерии, 119991 Москва
Поступила в редакцию 25.12.14 После доработки 12.01.15
Митохондрии в эндотелиальных клетках выполняют важные регуляторные функции как при нормальных физиологических процессах, так и при патологических состояниях, связанных с воспалением. Мы исследовали влияние низких концентраций разобщителей окислительного фосфорилирования на воспалительную активацию эндотелиальных клеток, использовав как классические разобщители 2,4-динитрофенол (ДНФ) и 4,5,6,7-тетрахлоро-2-трифторметилбензимидазол (ТТФБ), так и митохондриально-направленный кати-онный разобщитель додецилтифенилфосфоний (С12ТРР). Было показано, что разобщители подавляли экспрессию E-селектина и молекул адгезии ICAM1 и VCAM1, а также адгезию нейтрофилов на поверхности эндотелия, стимулированную фактором некроза опухолей (TNF). Механизм противовоспалительного действия разобщителей был, по крайней мере, отчасти, связан с подавлением активации транскрипционного фактора NFkB за счет снижения фосфорилирования его ингибирующей субъединицы 1кВа. Диапазон концентраций С12ТРР, при которых наблюдалось подавление экспрессии ICAM1, был на 3 порядка шире, чем у классических разобщителей. Предположительно при снижении мембранного потенциала уменьшается накопление проникающих катионов в митохондриях, что снижает их разобщающую активность и предотвращает дальнейшее падение потенциала. Восстановление мембранного потенциала после удаления разобщителей не отменяло их противовоспалительное действие. Таким образом, «мягкое» разобщение может быть стимулом для активации механизмов, обеспечивающих резистентность эндотелиальных клеток к действию TNF. Мы не обнаружили заметного влияния разобщителей на биогенез митохондрий и активацию аутофагии, однако было отмечено уменьшение фракции фрагментированных митохондрий, что указывало на вероятное изменение их сигнальных свойств. Ранее мы показали, что как классические, так и ми-тохондриально-направленные антиоксиданты подавляют NFKB-зависимую активацию эндотелия под действием TNF. Полученные данные позволяют предположить, что противовоспалительное действие «мягкого» разобщения связано с его антиоксидантным действием.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: воспаление, эндотелий, молекулы адгезии, митохондрии, разобщение окислительного фосфорилирования, проникающие катионы семейства SkQ.
Принятые сокращения: ДНФ — 2,4-динитрофенол; ТТФБ — 4,5,6,7-тетрахлоро-2-трифторметилбензимидазол; С12ТРР — додецилтифенилфосфоний; SkQ1 — пластохинолил-10(6'-децилтрифенил)фосфоний; TNF — фактор некроза опухолей; АФК — активные формы кислорода; NAC — N-ацетилцистеин; ЭТС — эмбриональная телячья сыворотка; TMRM — метиловый эфир тетраметилродамина; мтДНК — митохондриальная ДНК; яДНК — ядерная ДНК.
* Адресат для корреспонденции.
Повышение уровня фактора некроза опухолей (TNF) в крови вызывает аномальную активацию эндотелия и его повреждение (эндотели-альные дисфункции) [1—4]. Один из основных механизмов активации эндотелия под действием воспалительных цитокинов заключается в индукции экспрессии молекул адгезии (таких как ICAM1 и VCAM1) и селектинов (таких как Е-селектин и Р-селектин) на поверхности эндо-телиальных клеток. Эти молекулы обеспечивают адгезию и последующую трансмиграцию лейкоцитов через сосудистый барьер в ткани [5]. Основной регулятор экспрессии молекул адгезии при действии TNF — транскрипционный фактор NFkB [6].
Исследования последних лет показали, что митохондрии модулируют ответ различных клеток на воспалительные стимулы [7—9]. В эндо-телиальных клетках митохондрии, не являясь основным источником АТФ [10], играют важнейшую сигнальную роль как в норме, так и при патологических состояниях эндотелия [9, 11—13]. Предполагается, что митохондрии эндо-телиальных клеток являются гомеостатически-ми регуляторами кальциевой сигнальной системы [14], а также генерации NO и активных форм кислорода (АФК) [15]. Показано, что активация эндотелия, вызванная TNF, снижается под действием ингибитора первого комплекса дыхательной цепи митохондрий и ингибиторов открытия митохондриальной поры [16]. АФК играют важную роль в сосудистой физиологии и патофизиологии [17]. Ранее мы показали, что в эн-дотелиальных клетках митохондриальные АФК передают сигнал апоптоза, вызванного высокими дозами TNF [18]. Известно, что TNF вызывает продукцию АФК, в т.ч. митохондриальных [19, 20]. Недавно мы показали [21], что у старых мышей, длительное время получавших митохонд-риально-направленный антиоксидант SkQ1, снижается экспрессия молекул адгезии в аортах. В эндотелиальных клетках SkQ1, а также классические антиоксиданты в тысячекратно более высоких концентрациях ингибировали TNF-зави-симую активацию NFkB [21]. Активация NF-kB может регулироваться различными редокс-чувствительными компонентами сигнальных путей, однако противоречивые данные, полученные в разных лабораториях, не позволяют составить полную картину происходящего [22].
Известно, что небольшое снижение мембранного потенциала митохондрий, не останавливая синтез АТФ (так называемое «мягкое» разобщение), может значительно снизить генерацию АФК в митохондриях [23—25]. В клетках эндотелия как разобщители окислительного фосфорилирования, так и повышенная экс-
прессия митохондриальных разобщающих белков (UCP) снижали генерацию АФК митохондриями [26—29]. В модели ex vivo на коронарных артериях старых крыс разобщитель карбонил-цианид-4-трифторметоксифенилгидразон (FCCP) снижал митохондриальный окислительный стресс и NFKB-зависимую экспрессию молекул адгезии [30]. Предполагается, что в клетках разобщители могут действовать, во-первых, не допуская гиперполяризации митохондрий и тем самым подавляя генерацию АФК [25], и, во-вторых, индуцируя экспрессию антиокси-дантных ферментов [31].
Ранее было показано, что проникающие катионы могут проявлять свойства «мягких» мито-хондриально-направленных разобщителей [24, 25]. Эти соединения способствуют циклическому трансмембранному переносу жирных кислот, стимулируя их протонофорную активность. Снижение мембранного потенциала уменьшает накопление катионов в митохондриях и тем самым снижает их разобщающую активность. Таким образом, липофильные катионы приобретают свойства саморегулирующихся разобщителей, вызывая ограниченную деполяризацию мембраны митохондрий в широком диапазоне концентраций.
Целью нашей работы было изучение механизма действия митохондриально-направлен-ных разобщителей на воспалительную активацию клеток эндотелия. Мы показали, что длительное воздействие липофильного катиона C12TPP, а также классических разобщителей (ДНФ, ТТФБ) приводит к подавлению NFkB-зависимой экспрессии молекул адгезии и снижению сорбции нейтрофилов на поверхности клеток эндотелия, стимулированных TNF.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клеточные культуры. Человеческие эндоте-лиальные клетки линии EA.hy926 растили на среде DMEM («Gibco», США), содержавшей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («HyClone», США) и HAT (гипоксантин/ами-ноптерин/тирозин) («Sigma», США). Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), которые были любезно предоставлены М.А. Лагарьковой (Институт общей генетики РАН), выращивали на среде для первичных культур эндотелиальных клеток, содержавшей все необходимые добавки (EGM-2 BulletKit, «Lonza», США), и использовали в экспериментах на 2—4 пассажах. Культуральные матрасы и планшеты, используемые для HUVEC, предварительно обрабатывали 2%-ным водным
раствором желатина («Sigma», США). Клетки человеческой промиелоцитной лимфомы линии HL-60 выращивали на среде RPMI 1640 («Gibco», США), содержавшей 10% ЭТС («HyClone», США). Все клетки культивировали при 37° в присутствии 5%-ного CO2.
Проникающие катионы (C12TPP и SkQ1; синтезированы Г.А. Коршуновой и Н.В. Сумба-тян, НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова); разобщители (ДНФ и ТТФБ), олигомицин и дезоксиглюкозу («Sigma», США) добавляли к полностью конфлюэнтному монослою клеток EA.hy926 за 3 ч до измерения мембранного потенциала митохондрий или за 12 ч до измерения содержания АТФ. Во всех остальных опытах эндотелиальные клетки культивировали до полностью конфлюэнтного монослоя (3 дня) в присутствии проникающих катионов, разобщителей и антиоксидантов, а затем меняли культуральную среду на новую, содержавшую 0,2%-ную ЭТС, и через 12 ч добавляли TNF (любезно предоставлен Л.Н. Шингаровой, ИБХ РАН).
Оценка мембранного потенциала митохондрий. Мембранный потенциал митохондрий оценивали, используя флуоресцентный зонд TMRM («Sigma», США), который электрофоретически накапливается в митохондриях. Клетки инкубировали с TMRM (100 нМ, 15 мин), затем снимали с планшетов раствором трипсина с ЭДТА («Gibco», США) и измеряли флуоресценцию с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter Cytomics FC 500, «Beckman Coulter», США).
Измерение содержания АТФ в клетках. Содержание АТФ в клетках измеряли, используя набор «ATP Bioluminescence Assay Kit CLS II» («Hoffmann-La Roche», Швейцария). Пробы подготавливали согласно рекомендациям производителя. Измерения проводили на планшетном люменометре (Victor X5, «PerkinElmer», США).
Выделение ДНК, РНК и обратная транскрипция. ДНК выделяли с помощью набора «DNeasy Blood & Tissue» («Qiagen», США), а РНК — с помощью набора «RNeasy Mini K
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.