научная статья по теме НИЗКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ РАЗОБЩИТЕЛЕЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ПРЕДОТВРАЩАЮТ ВОСПАЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВАЦИЮ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ВЫЗВАННУЮ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ Химия

Текст научной статьи на тему «НИЗКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ РАЗОБЩИТЕЛЕЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ПРЕДОТВРАЩАЮТ ВОСПАЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВАЦИЮ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ВЫЗВАННУЮ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 5, с. 723 - 734

УДК 577.3

НИЗКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ РАЗОБЩИТЕЛЕЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

ПРЕДОТВРАЩАЮТ ВОСПАЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВАЦИЮ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ВЫЗВАННУЮ ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ

© 2015 В.П. Ромащенко12, Р.А. Зиновкин134, И.И. Галкин1, В.В. Захарова1,2, А.А. Пантелеева1, А.В. Токарчук1,2, К.Г. Лямзаев1,4, О.Ю. Плетюшкина14, Б.В. Черняк14, Е.Н. Попова14*

1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; электронная почта: k_popova_ch@mail.ru

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991 Москва

3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

биологический факультет, 119991 Москва

4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

НИИ Митоинженерии, 119991 Москва

Поступила в редакцию 25.12.14 После доработки 12.01.15

Митохондрии в эндотелиальных клетках выполняют важные регуляторные функции как при нормальных физиологических процессах, так и при патологических состояниях, связанных с воспалением. Мы исследовали влияние низких концентраций разобщителей окислительного фосфорилирования на воспалительную активацию эндотелиальных клеток, использовав как классические разобщители 2,4-динитрофенол (ДНФ) и 4,5,6,7-тетрахлоро-2-трифторметилбензимидазол (ТТФБ), так и митохондриально-направленный кати-онный разобщитель додецилтифенилфосфоний (С12ТРР). Было показано, что разобщители подавляли экспрессию E-селектина и молекул адгезии ICAM1 и VCAM1, а также адгезию нейтрофилов на поверхности эндотелия, стимулированную фактором некроза опухолей (TNF). Механизм противовоспалительного действия разобщителей был, по крайней мере, отчасти, связан с подавлением активации транскрипционного фактора NFkB за счет снижения фосфорилирования его ингибирующей субъединицы 1кВа. Диапазон концентраций С12ТРР, при которых наблюдалось подавление экспрессии ICAM1, был на 3 порядка шире, чем у классических разобщителей. Предположительно при снижении мембранного потенциала уменьшается накопление проникающих катионов в митохондриях, что снижает их разобщающую активность и предотвращает дальнейшее падение потенциала. Восстановление мембранного потенциала после удаления разобщителей не отменяло их противовоспалительное действие. Таким образом, «мягкое» разобщение может быть стимулом для активации механизмов, обеспечивающих резистентность эндотелиальных клеток к действию TNF. Мы не обнаружили заметного влияния разобщителей на биогенез митохондрий и активацию аутофагии, однако было отмечено уменьшение фракции фрагментированных митохондрий, что указывало на вероятное изменение их сигнальных свойств. Ранее мы показали, что как классические, так и ми-тохондриально-направленные антиоксиданты подавляют NFKB-зависимую активацию эндотелия под действием TNF. Полученные данные позволяют предположить, что противовоспалительное действие «мягкого» разобщения связано с его антиоксидантным действием.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: воспаление, эндотелий, молекулы адгезии, митохондрии, разобщение окислительного фосфорилирования, проникающие катионы семейства SkQ.

Принятые сокращения: ДНФ — 2,4-динитрофенол; ТТФБ — 4,5,6,7-тетрахлоро-2-трифторметилбензимидазол; С12ТРР — додецилтифенилфосфоний; SkQ1 — пластохинолил-10(6'-децилтрифенил)фосфоний; TNF — фактор некроза опухолей; АФК — активные формы кислорода; NAC — N-ацетилцистеин; ЭТС — эмбриональная телячья сыворотка; TMRM — метиловый эфир тетраметилродамина; мтДНК — митохондриальная ДНК; яДНК — ядерная ДНК.

* Адресат для корреспонденции.

Повышение уровня фактора некроза опухолей (TNF) в крови вызывает аномальную активацию эндотелия и его повреждение (эндотели-альные дисфункции) [1—4]. Один из основных механизмов активации эндотелия под действием воспалительных цитокинов заключается в индукции экспрессии молекул адгезии (таких как ICAM1 и VCAM1) и селектинов (таких как Е-селектин и Р-селектин) на поверхности эндо-телиальных клеток. Эти молекулы обеспечивают адгезию и последующую трансмиграцию лейкоцитов через сосудистый барьер в ткани [5]. Основной регулятор экспрессии молекул адгезии при действии TNF — транскрипционный фактор NFkB [6].

Исследования последних лет показали, что митохондрии модулируют ответ различных клеток на воспалительные стимулы [7—9]. В эндо-телиальных клетках митохондрии, не являясь основным источником АТФ [10], играют важнейшую сигнальную роль как в норме, так и при патологических состояниях эндотелия [9, 11—13]. Предполагается, что митохондрии эндо-телиальных клеток являются гомеостатически-ми регуляторами кальциевой сигнальной системы [14], а также генерации NO и активных форм кислорода (АФК) [15]. Показано, что активация эндотелия, вызванная TNF, снижается под действием ингибитора первого комплекса дыхательной цепи митохондрий и ингибиторов открытия митохондриальной поры [16]. АФК играют важную роль в сосудистой физиологии и патофизиологии [17]. Ранее мы показали, что в эн-дотелиальных клетках митохондриальные АФК передают сигнал апоптоза, вызванного высокими дозами TNF [18]. Известно, что TNF вызывает продукцию АФК, в т.ч. митохондриальных [19, 20]. Недавно мы показали [21], что у старых мышей, длительное время получавших митохонд-риально-направленный антиоксидант SkQ1, снижается экспрессия молекул адгезии в аортах. В эндотелиальных клетках SkQ1, а также классические антиоксиданты в тысячекратно более высоких концентрациях ингибировали TNF-зави-симую активацию NFkB [21]. Активация NF-kB может регулироваться различными редокс-чувствительными компонентами сигнальных путей, однако противоречивые данные, полученные в разных лабораториях, не позволяют составить полную картину происходящего [22].

Известно, что небольшое снижение мембранного потенциала митохондрий, не останавливая синтез АТФ (так называемое «мягкое» разобщение), может значительно снизить генерацию АФК в митохондриях [23—25]. В клетках эндотелия как разобщители окислительного фосфорилирования, так и повышенная экс-

прессия митохондриальных разобщающих белков (UCP) снижали генерацию АФК митохондриями [26—29]. В модели ex vivo на коронарных артериях старых крыс разобщитель карбонил-цианид-4-трифторметоксифенилгидразон (FCCP) снижал митохондриальный окислительный стресс и NFKB-зависимую экспрессию молекул адгезии [30]. Предполагается, что в клетках разобщители могут действовать, во-первых, не допуская гиперполяризации митохондрий и тем самым подавляя генерацию АФК [25], и, во-вторых, индуцируя экспрессию антиокси-дантных ферментов [31].

Ранее было показано, что проникающие катионы могут проявлять свойства «мягких» мито-хондриально-направленных разобщителей [24, 25]. Эти соединения способствуют циклическому трансмембранному переносу жирных кислот, стимулируя их протонофорную активность. Снижение мембранного потенциала уменьшает накопление катионов в митохондриях и тем самым снижает их разобщающую активность. Таким образом, липофильные катионы приобретают свойства саморегулирующихся разобщителей, вызывая ограниченную деполяризацию мембраны митохондрий в широком диапазоне концентраций.

Целью нашей работы было изучение механизма действия митохондриально-направлен-ных разобщителей на воспалительную активацию клеток эндотелия. Мы показали, что длительное воздействие липофильного катиона C12TPP, а также классических разобщителей (ДНФ, ТТФБ) приводит к подавлению NFkB-зависимой экспрессии молекул адгезии и снижению сорбции нейтрофилов на поверхности клеток эндотелия, стимулированных TNF.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные культуры. Человеческие эндоте-лиальные клетки линии EA.hy926 растили на среде DMEM («Gibco», США), содержавшей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («HyClone», США) и HAT (гипоксантин/ами-ноптерин/тирозин) («Sigma», США). Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), которые были любезно предоставлены М.А. Лагарьковой (Институт общей генетики РАН), выращивали на среде для первичных культур эндотелиальных клеток, содержавшей все необходимые добавки (EGM-2 BulletKit, «Lonza», США), и использовали в экспериментах на 2—4 пассажах. Культуральные матрасы и планшеты, используемые для HUVEC, предварительно обрабатывали 2%-ным водным

раствором желатина («Sigma», США). Клетки человеческой промиелоцитной лимфомы линии HL-60 выращивали на среде RPMI 1640 («Gibco», США), содержавшей 10% ЭТС («HyClone», США). Все клетки культивировали при 37° в присутствии 5%-ного CO2.

Проникающие катионы (C12TPP и SkQ1; синтезированы Г.А. Коршуновой и Н.В. Сумба-тян, НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова); разобщители (ДНФ и ТТФБ), олигомицин и дезоксиглюкозу («Sigma», США) добавляли к полностью конфлюэнтному монослою клеток EA.hy926 за 3 ч до измерения мембранного потенциала митохондрий или за 12 ч до измерения содержания АТФ. Во всех остальных опытах эндотелиальные клетки культивировали до полностью конфлюэнтного монослоя (3 дня) в присутствии проникающих катионов, разобщителей и антиоксидантов, а затем меняли культуральную среду на новую, содержавшую 0,2%-ную ЭТС, и через 12 ч добавляли TNF (любезно предоставлен Л.Н. Шингаровой, ИБХ РАН).

Оценка мембранного потенциала митохондрий. Мембранный потенциал митохондрий оценивали, используя флуоресцентный зонд TMRM («Sigma», США), который электрофоретически накапливается в митохондриях. Клетки инкубировали с TMRM (100 нМ, 15 мин), затем снимали с планшетов раствором трипсина с ЭДТА («Gibco», США) и измеряли флуоресценцию с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter Cytomics FC 500, «Beckman Coulter», США).

Измерение содержания АТФ в клетках. Содержание АТФ в клетках измеряли, используя набор «ATP Bioluminescence Assay Kit CLS II» («Hoffmann-La Roche», Швейцария). Пробы подготавливали согласно рекомендациям производителя. Измерения проводили на планшетном люменометре (Victor X5, «PerkinElmer», США).

Выделение ДНК, РНК и обратная транскрипция. ДНК выделяли с помощью набора «DNeasy Blood & Tissue» («Qiagen», США), а РНК — с помощью набора «RNeasy Mini K

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком