ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 2, с. 263-265
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.171.22:591.25:595.77
НОКДАУН ГЕНА InR В ВЕНТРАЛЬНЫХ НЕФРОЦИТАХ ПОВЫШАЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ САМОК Drosophila melanogaster К ТОКСИЧЕСКОМУ СТРЕССУ
© 2015 г. О. В. Андреенкова, Е. К. Карпова, П. Н. Меньшанов, И. Ю. Раушенбах
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090
e-mail: andreenk@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 14.04.2014 г.
Фильтрация гемолимфы у насекомых осуществляется нефроцитами — дополнительными клетками циркуляторной системы, не связанными с мальпигиевыми сосудами. У дрозофилы два типа нефро-цитов — вентральные ("гирляндные"), расположенные вокруг соединения пищевода с провентри-кулусом, и перикардиальные, локализованные вокруг сердца. В настоящей работе исследована роль гена инсулиноподобного рецептора (InR) в контроле функционирования вентральных нефроцитов (ВНЦ) самок D. melanogaster. Иммуногистохимический анализ ВНЦ самок с использованием антител против InR впервые показал, что ген InR экспрессируется в этих клетках. Для того чтобы исследовать, влияет ли изменение уровня экспрессии InR на функционирование ВНЦ у самок дрозофилы, использовали антисмысловой супрессор гена InR совместно с драйвером, специфически экс-прессирующимся в ВНЦ. Функционирование ВНЦ оценивали по выживаемости самок, подвергнутых токсическому стрессу (обработке AgNO3). Впервые продемонстрировано, что подавление экспрессии InR в ВНЦ вызывает повышение выживаемости мух в условиях токсического стресса.
DOI: 10.7868/S0016675815020022
Поддержание гомеостаза в живом организме — важный и сложный процесс. У млекопитающих органом, поддерживающим гомеостаз, являются почки, основные функции которых, выделительная и осморегулирующая, достигаются процессами фильтрации и секреции. В клубочках нефро-нов происходит фильтрация крови под давлением (ультрафильтрация), в канальцах — секреция и реабсорбция отдельных веществ [1, 2]. У насекомых функции фильтрации гемолимфы и экскреции выполняются разными тканями, разобщенными в пространстве: для выделения служат мальпигиевы сосуды, тогда как фильтрация с последующим эндоцитозом происходит в нефроци-тах — дополнительных клетках открытой цирку-ляторной системы насекомых, не связанных с мальпигиевыми сосудами [3]. Предполагается, что у насекомых система нефроциты/мальпигие-вы сосуды представляет собой аналог почки [1, 2].
У дрозофилы два типа нефроцитов: вентральные (или "гирляндные" клетки) и перикардиальные. Вентральные нефроциты (ВНЦ) представляют собой гигантские двухъядерные клетки, расположенные в виде "гирлянды" вокруг переднего конца провентрикулуса в месте его соединения с пищеводом. Перикардиальные нефроциты — одноядерные клетки, расположенные рядами с каждой стороны сердца [2, 4].
Несколько лет назад нефроциты были "переоткрыты" как молекулярные и функциональ-
ные аналоги подоцитов млекопитающих, формирующих фильтрационный барьер в почечных клубочках [2, 4, 5]. Это открытие вызвало большой интерес к нефроцитам насекомых как к модели для изучения механизмов функционирования подоцитов и связанных с ними заболеваний [1, 2].
Одним из гормонов, контролирующих сосудистые и почечные функции млекопитающих, такие как кровяное давление, солевой и водный го-меостаз, является инсулин, действие которого опосредуется рецептором инсулина — InR [6—8]. Совсем недавно было показано, что подоциты млекопитающих инсулин-зависимы [9]. На культуре дифференцированных подоцитов человека был исследован эффект добавления в среду инсулина. Было показано, что инсулин регулирует поглощение глюкозы подоцитами, стимулируя траспортеры глюкозы GLUTI и GLUT4 [9]. Для изучения роли инсулиновых рецепторов в почках млекопитающих были созданы нокаутные мыши со специфической делецией инсулинового рецептора в подоцитах [10]. У таких животных развивались симптомы, напоминающие диабетическую нефропатию [10]. Эта работа показывает значение инсулиновой чувствительности подо-цитов для почечной функции.
Сигнальный путь инсулина/инсулиноподоб-ных факторов роста дрозофилы хорошо изучен. Он включает семь инсулиноподобных пептидов
263
9*
264
АНДРЕЕНКОВА и др.
Выживаемость, % 100
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
И1^
Ч-Ш-кг^
н^з—^—^—^з
■к
'i-
1/Н-к \
^ *** > ***
Kl
'••и
t
- - Aug21>/p[UAS-RNAi-InR]
- » - Aug21>/p[UAS-RNAi-InR], обработанные AgNO3
p[UAS-RNAi-InR]/CyO::arm-GFP - p[UAS-RNAi-InR]/CyO::arm-GFP, обработанные AgNO3
TTT
J ***
TTT
" T
TT
TT
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14 15 16 17 18 19 20 Дни после вылупления
Рис. 3. Выживаемость самок Aug21>/p[UAS-RNAi-InR\ ир[иАЗ-ЕЫА1-1пЩ/Суо::агт-0¥Р, кормленных ^N03 и контрольных. Каждая точка — среднее значение из 20 тестов. *** — достоверность различий между Aug21>/p[UAS-RNAi-1пК\ и p[UAS-RNAi-InR\/Cyo::arm-GFP самками, обработанными ^N03 (р < 0.001).
(DILP1-7), транскрипционный фактор семейства Forkhead box class O (dFOXO), инсулиноподоб-ный рецептор InR и ортолог субстрата инсулино-вого рецептора млекопитающих — CHICO [11].
В настоящей работе мы впервые осуществили иммуногистохимическое исследование нефроци-тов дрозофилы, используя антитела против инсу-линового рецептора человека, и изучили влияние интенсивности экспрессии гена InR в нефроци-тах на их функционирование.
В экспериментах использованы две линии D. melanogaster. 1) трансгенная линия p[UAS-RNAi-InR]/CyO, несущая генетическую конструкцию — антисмысловой супрессор гена InR [12], и 2) трансгенная линия Aug21-Gal4/CyO::arm-GFP, несущая драйвер Aug21-Gal4 (Aug21>), специфически экспрессирующийся в ВНЦ имаго дрозофилы и corpus allatum — железе, синтезирующей ювенильный гормон [13]. Линии, использованные в работе, были проверены на присутствие вольбахии (не инфицированы) и содержались в идентичных пищевых и температурных условиях. При скрещивании этих линий получается два типа потомства: 1) Aug21>/p[UAS-RNAi-InR] со сниженной экспрессией гена InR в ВНЦ и corpus allatum и 2) p[UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP с неизмененным уровнем инсулиновых рецепторов, поскольку без драйвера Aug21> конструкция UAS-RNAi-InR не экспрессируется [13]. Иммуногистохимическое окрашивание проводили, как описано ранее [13]. Анализ препаратов проводился в межинститутском центре микроскопического анализа биологических объектов СО РАН (Но-
восибирск) на микроскопе Axioscope 2 plus (Zeiss).
На рис. 1 представлены ВНЦ взрослых самок гибридов Aug21>/p [ UAS-RNAi-InR] иp [ UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP, окрашенные антителами против инсулинового рецептора человека. Хорошо видно, что инсулиноподобные рецепторы присутствуют в нефроцитах. Видно также, что интенсивность экспрессии InR в ВНЦ самок Aug21>/ p[UAS-RNAi-InR] (рис. 1,а) резко снижена по сравнению с контрольными p[UAS-RNAi-InR]/ Cyo::arm-GFP особями (рис. 1,5).
Для того чтобы исследовать роль гена InR в контроле функционирования ВНЦ, мы оценили устойчивость самок Aug21>/p[UAS-RNAi-InR] и p[UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP к токсическому стрессу. Токсические условия были созданы добавлением AgNO3 в культуральную среду [2, 14]. Данные, представленные на рис. 2, ясно показывают преципитацию нитрата серебра (коричневые гранулы) в ВНЦ мух, содержащихся на среде с AgNO3 (рис. 2,б). Для сравнения на рис. 2,а представлены ВНЦ мух, которым в питательную среду не добавляли AgNO3.
На рис. 3 приведены результаты оценки выживаемости обрабатываемых AgNO3 и контрольных самок Aug21>/p[UAS-RNAi-InR] со сниженной экспрессией InR в ВНЦ и их сибсов p[UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP с нормальной экспрессией InR в ВНЦ. Хорошо видно, что обработка AgNO3 снижает жизнеспособность особей обоих генотипов. Однако самки Aug21>/p[UAS-RNAi-InR] характеризуются повышенной устойчивостью к токсиче-
ГЕНЕТИКА том 51 № 2 2015
НОКДАУН ГЕНА InR В ВЕНТРАЛЬНЫХ НЕФРОЦИТАХ
265
скому стрессу: начиная с 15-го дня обработки различия с самками p[UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP становятся достоверными и к 20-му дню эксперимента выживает 46% Aug21>/p[UAS-RNAi-InR] самок и 14% самок p[UAS-RNAi-InR]/Cyo::arm-GFP. Сравнение влияния снижения экспрессии InR в ВНЦ и возраста на выживаемость самок в условиях токсического стресса двухфакторным ANOVA смешанного дизайна (дни после вылета — фактор повторных измерений, генотип — простой фактор) выявило значительное влияние генотипа (F(1, 38) = 5.93, p < 0.05) и возраста (F(17, 646) = = 150.90, p < 0.00001) на скорость гибели самок в условиях токсического стресса.
Итак, мы впервые продемонстрировали, что ген InR экспрессируется в вентральных нефроцитах имаго дрозофилы, и сигнальный путь инсулина/ инсулиноподобных факторов роста участвует в регуляции их функционирования.
Настоящее исследование поддержано грантами РФФИ № 12-04-31893 мол-а и БП № VI.53.2.3.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Dow J.A., Romero M.F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease // Amer. J. Physiol. Renal Physiol. 2010. V. 299. F1237-F1244.
2. Weavers H., Prieto-Sanchez S., Grawe F. et al. The insect nephrocyte is a podocyte-like cell with a filtration slit diaphragm // Nature. 2009. V. 457. P. 322-326.
3. Denholm B., Skaer H. Bringing together components of the fly renal system // Current Opinion in Genetics & Development. 2009. V. 19. P. 526-532.
4. Cagan R.L. The Drosophila nephrocyte // Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 2011. V 20. P. 409-415.
5. Zhuang Sh., Shao H., Guo F. et al. Sns and Kirre, the Drosophila orthologs of Nephrin and Neph1, direct adhesion, fusion and formation of a slit diaphragm-like structure in insect nephrocytes // Development. 2009. V. 136. P. 2335-2344.
6. Tiwari S., Riazi Sh., Ecelbarger C.A. Insulin's impact on renal sodium transport and blood pressure in health, obesity, and diabetes // Amer. J. Physiol. Renal Physiol. 2007. V. 293. F974-F984.
7. Iglesias P., Diez J.J. Insulin therapy in renal disease // Diabetes Obes. Metab. 2008. V 10. P. 811-23.
8. Catena C., Cavarape A., Novello M. et al. Insulin receptors and renal sodium handling in hypertensive fructose-fed rats // Kidney Int. 2003. V. 64. P. 2163-2171.
9. Coward R.J.M., Welsh G.I.,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.