БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 3, с. 449 - 455
УДК 612.12
НОРМАЛЬНЫЙ УРОВЕНЬ СЕПСИС-АССОЦИИРОВАННЫХ ФЕНИЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
© 2015 Н.В. Белобородова1*, В.В. Мороз1, А.А. Осипов12, А.Ю. Бедова1, А.Ю. Оленин1, М.Л. Гецина1, О.В. Карпова2, Е.Г. Оленина3
1 Институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского, 107031 Москва, ул. Петровка, 25, стр. 2; факс: +7(495)694-2708, электронная почта: nvbeloborodova@yandex.ru
2 Федеральный научно-клинический центр детской гематологии,
онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева Минздрава РФ, 117997Москва, ул. Саморы Машела, 1; факс: +7(495)664-7090
3 Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы, 119361 Москва, ул. Озерная, 36; факс: +7(495)437-5666, электронная почта: olenina@vniims.ru
Поступила в редакцию 10.11.14 После доработки 08.12.14
Известно, что в крови больных с сепсисом накапливаются большие количества фенилкарбоновых кислот (ФКК) за счет усиленной биотрансформации фенилаланина и тирозина с участием микробиоты. Традиционно у людей без наследственных моногенетических заболеваний путь биохимического превращения ароматических аминокислот в ФКК считают функционально незначимым. В данной работе показано, что ФКК, характерные для больных с сепсисом, присутствуют и в крови здоровых людей. Методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием установлено, что общий уровень ФКК в сыворотке крови составляет в среднем 6 мкМ и является стабильным биохимическим показателем, отражая нормальный метаболизм ароматических аминокислот. Относительные концентрации ФКК в метаболическом профиле здоровых людей распределяются следующим образом: фенилуксусная « р-гидроксифенилмолоч-ная > р-гидроксифенилуксусная > фенилмолочная « фенилпропионовая > бензойная. По мнению авторов поддержание стабильных уровней ФКК в сыворотке крови обеспечивается в результате интеграции эндогенных метаболических путей человека и микробиоты.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: метаболизм тирозина, сепсис, фенилкарбоновые кислоты, фенилмолочная кислота, р-гидроксифенилмолочная кислота, фенилпропионовая кислота, бензойная кислота, микробиота.
Ранее в крови больных в критических состояниях была идентифицирована группа низкомолекулярных фенилкарбоновых кислот (ФКК), качественно-количественный состав которых (далее - профиль) был значительно изменен по сравнению с кровью здорового человека [1]. Эти химические соединения, а именно бензойная (БК), р-гидроксибензойная (р-ГБ), фенилпропионовая (ФПК), р-гидроксифенил-
пропионовая (р-ГФПК), фенилуксусная (ФУК), р-гидроксифенилуксусная (р-ГФУК), фенилмолочная (ФМК), р-гидроксифенилмолочная (р-ГФМК) кислоты, являются метаболитами фенилаланина и тирозина — ключевых аминокислот, участвующих в механизмах адаптации и регуляции [2—5]. При отсутствии наследственных моногенетических заболеваний (фенилкетону-рии и тирозинемии) профиль ФКК относитель-
Принятые сокращения: ФКК — фенилкарбоновые кислоты; БК — бензойная кислота; ФПК — фенилпропионовая кислота; р-ГФПК — гидроксифенилпропионовая кислота; ФУК — фенилуксусная кислота; р-ГФУК — гидроксифенилук-сусная кислота; ФМК — фенилмолочная кислота; р-ГФМК — гидроксифенилмолочная кислота; ГХ-ПИД — газовая хроматография с пламенно-ионизационным детектированием; ГХ-МС — газовая хроматография с масс-спектрометрией; 3,4-ФГБК — 3,4-дигидроксибензойная кислота; ТМС-производное — триметилсилильное производное; ИР — интерквар-тильный размах; ПР — процентильный размах; гг — коэффициент корреляции Спирмена.
* Адресат для корреспонденции.
10
449
но нормы имеет наибольшие отклонения у больных с сепсисом [1, 6]. Поэтому данную группу метаболитов можно назвать «сепсис-ас-социированными ФКК» [6—8].
ФКК широко распространены в природе и обладают биорегуляторной активностью [7]. Существует мнение, что ФКК участвуют в аллело-патии — свойстве организмов выделять химические соединения, которые тормозят или подавляют размножение других организмов. БК, ФУК и ФПК в наибольшей степени способны подавлять рост Escherichia coli, при этом энтеро-патогенный штамм более чувствителен к ним. ФУК и ФПК сильнее подавляют рост Staphylococcus aureus, чем их гидроксилированные производные [9, 10]. Результаты других микробиологических исследований, в т.ч. данные о противогрибковой активности ФМК и p-ГФМК, обобщены нами ранее [7]. Известны и более тонкие эффекты этой группы метаболитов. Так, ФКК влияют на интенсивность клеточного дыхания и модулируют продукцию активных форм кислорода (АФК) в митохондриях, влияют на образование оксида азота (NO), снижают продукцию АФК в нейтрофилах [7, 11—13]. Вместе с тем механизмы действия ФКК на живые клетки остаются малоизученными.
В классической биохимии человека принято рассматривать ФКК как метаболиты альтернативного и функционально незначимого для человека пути трансформации фенилаланина и тирозина. Аргументом в пользу этого являются данные о том, что ФКК проявляют свои биорегуля-торные свойства в концентрациях, существенно превышающих их нормальный уровень в сыворотке [7]. Однако при этом не учитывается, что в организме здорового человека существует так называемый «забытый орган» — кишечная микро-биота, которая может создавать в кишечнике биологически активные концентрации ФКК [5, 7, 14, 15]. Вопрос о преимущественном источнике (эндогенном или микробном) ФКК в сыворотке крови человека представляет интерес не только в фундаментальном, но и в прикладном аспекте. Так, в наших предыдущих работах показана перспективность анализа метаболического профиля сепсис-ассоциированных ФКК у реаниматологических больных для объективной оценки тяжести их состояния, а также для мониторинга эффективности проводимого лечения [1, 16].
Цель данной работы — установление уровня сепсис-ассоциированных ФКК в сыворотке крови здоровых людей. Это необходимо для дальнейшего изучения механизмов участия ФКК в патогенезе заболеваний и критических состояний, а также для разработки диагностических критериев.
Основной экспериментальный метод — газовая хроматография с пламенно-ионизационным детектированием (ГХ-ПИД). Традиционным методом количественного определения феноль-ных соединений в биологических жидкостях является газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) [1, 14, 17]. Важными преимуществами данного метода является его селективность и чувствительность, а основным недостатком — высокая стоимость оборудования. Для повышения доступности метаболом-ного анализа нами выполнена работа по замене масс-спектрального детектора на пламенно-ионизационный, а также показано, что модифицированный метод ГХ-ПИД при работе на доступном отечественном газовом хроматографе пригоден для количественного измерения уровня анализируемых сепсис-ассоциированных ФКК и не уступает по чувствительности ГХ-МС [18].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Группа доноров крови. Исследованы образцы сыворотки венозной крови 72 здоровых доноров старше 18 лет. Набор образцов сыворотки осуществлялся в отделении трансфузиологии, заготовки и процессинга гемопоэтических стволовых клеток в соответствии с принятыми нормами. Отбор образца крови производили в закрытые чистые пластиковые пробирки без консервантов, активаторов коагуляции и других реагентов. Цельную кровь центрифугировали в течение 15 мин при 800 g. Отобранные образцы сыворотки замораживали и хранили при —20°. Повторного размораживания—замораживания не допускалось.
Методика газохроматографического определения. Замороженный образец сыворотки размораживали непосредственно перед анализом при комнатной температуре. В стеклянную пробирку объемом 10 мл помещали 800 мкл воды для инъекций, 200 мкл сыворотки крови и 10 мкл метанола (<^1ика», США), содержавшего 400 нг 3,4-дигидроксибензойной кислоты («Асю Оща-шс8», США) (3,4-ДГБК, внутренний стандарт), 0,3—0,5 г твердого хлорида натрия до образования насыщенного раствора, концентрированную серную кислоту до рН 2. После денатурации белка проводили экстракцию органических соединений (3 х 1 мл) диэтиловым эфиром («Хим-мед», Россия). Полученный эфирный экстракт упаривали досуха при 40°, сухой остаток выдерживали под крышкой с 20 мкл М,0-бис(триме-тилсилил)трифторацетамида (<^1ика», США) при 80° в течение 15 мин для получения триме-
тилсилильных (ТМС) производных, затем полученную массу доводили до комнатной температуры и разбавляли 80 мкл н-гексана («Экос-1», Россия).
Анализ ФКК в образцах сыворотки проводили на газовом хроматографе Кристалл 5000.2 («Хроматэк», Россия), оснащенного пламенно-ионизационным детектором. Хроматографичес-кое разделение проводили на кварцевой капиллярной колонке CP SIL 5CB длиной 30 м, диаметром 0,32 мм с толщиной слоя неподвижной фазы 0,25 мкм. Газ-носитель — гелий, скорость потока через колонку — 1,2 мл/мин, объем анализируемой пробы — 2 мкл, деление потока — 1 : 25. Температурный режим анализа: температура испарителя 270°, начальная температура термостата колонки 80°, время выдержки 4 мин, далее нагрев до 240° со скоростью 7 град/мин и далее — до 270° со скоростью 15 град/мин, термостати-рование при 270° до конца анализа. Общее время анализа — 30 мин. Количество определяемого соединения оценивали сравнением площади его пика с площадью пика внутреннего стандарта. Времена удерживания и пределы обнаружения ТМС-производных приведены в табл. 1.
Статистический анализ. Обработку результатов проводили с применением программы SPSS Statistics 22. Соответствие распределения нормальному оценивали с применением одновыбо-рочного критерия Колмогорова—Смирнова. Описательная статистика в тексте представлена в виде медианы и интерквартильного размаха (ИР 25—75%), а в табл. 2 — более подробно с указанием максимального и минимального значения величин и процентильного размаха (ПР 5—95%). Для сравнения величин с нормальным распределением использовали i-тест для двух независимых выборок, для величин с отличным от нормального — критерий Манна—Уитни. При определении корреляционной связи рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена (rs). Критерий Краскела—Уоллиса использовали при сравнении нескольких независимых выборок. Значение p < 0,05
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.