ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.8+597.222+579.695
НОВАЯ БАКТЕРИЯ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩАЯ АНАЭРОБНОЕ ОКИСЛЕНИЕ АММОНИЯ В РЕАКТОРЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ФИЛЬТРАТА СБРОЖЕННОГО ОСАДКА СТОЧНЫХ ВОД
© 2013 г. С. В. Храменков*, М. Н. Козлов*, М. В. Кевбрина*, А. Г. Дорофеев*, Е. А. Казакова*, В. А. Грачев*, Б. Б. Кузнецов**, Д. Ю. Поляков**, Ю. А. Николаев*, 1
*ОАО "Мосводоканал" **Центр "Биоинженерия" РАН, Москва Поступила в редакцию 27.08.2012 г.
В работе представлено описание нового вида и рода бактерий, способных к окислению аммония в анаэробных условиях с использованием нитрита. Накопительная культура бактерий получена из ила реки Москвы путем его последовательного культивирования в реакторах с элективными условиями для анаэробного окисления аммония. Клетки бактерий коккоидной формы «0.4 х 0.7 мкм имеют внутриклеточные мембранные структуры, характерные для бактерий, способных к анаэробному окислению аммония — анаммоксосому, парифоплазму. Клетки объединены в агрегаты диаметром 5—25 мкм (в среднем — 10). Легко адгезируют к твердым поверхностям. Клетки морфологически лабильны — легко теряют содержимое, изменяют морфологию при фиксации для электронной микроскопии. Организм способен к окислению аммония нитритом. Константы полунасыщения Ks для нитрита и аммония составляют 0.38 мг N—NO2/n и 0.41 мг N—NH/л соответственно. Предельная концентрация нитрита для роста — однократно 90 мг N—NO2/n, постоянно — 75 мг N-NO^; время удвоения — 32 сут; цмакс = 0.022 сут-1; температурный оптимум роста 20°C, оптимум рН 7.8—8.3. На основании анализа 16S рРНК бактерия отнесена к новому роду и виду, входящим в группу Plancto-mycetes. Для новой бактерии предложено название Candidatus Anammoxomicrobium moscowii gen. nov., sp. nov. (микроб, осуществляющий процесс анаэробного окисления аммония, выделенный в московском регионе).
Ключевые слова: анаэробное окисление аммония, новые бактерии, описание, очистка сточных вод.
DOI: 10.7868/S002636561305008X
Бактерии, способные к окислению аммония нитритом в бескислородных условиях, анаммокс-бактерии (от anaerobic ammonia oxidation), были открыты относительно недавно, в 1999 г. [1]. Их открытие было предсказано на основании анализа возможных энергодающих биохимических реакций в 1977 г [2]. В настоящее время известно 8 видов анаммокс-бактерий 5 родов. Они обнаружены как в природных местообитаниях (на дне морей и пресноводных водоемов), так и на очистных сооружениях [3]. Этим бактериям присущи уникальные свойства: окисление аммония нитритом, образование специфического интер-медиата — гидразина, и особых липидов — "ладде-ранов" [4], наличие специфической мембранной внутриклеточной структуры — анаммоксосомы [5]. Для этих бактерий характерно существенно большее эволюционное расхождение внутри группы, чем для других групп бактерий [3]. Ввиду
1 Автор для корреспонденции (e-mail: nikolaevya@mail.ru).
того, что группа обнаружена относительно недавно, регулярно описываются новые виды, при этом считается, что каждое новое местообитание содержит, как правило, только один вид [6]. Интерес к анаммокс-бактериям вызван тем, что этой группе отводят важнейшую роль в круговороте азота в водных экосистемах (до 35% в океанах) [3, 7]. Их также выделяют из сооружений очистки сточных вод (более половины известных видов выделены из илов очистных сооружений) [3] и используют для создания технологий очистки сточных вод от аммония. В мире известно немногим более 10 примеров промышленного внедрения технологии анаммокс. ОАО "Мосводоканал" (Москва) внедрило на Курьяновских очистных сооружениях (КОС) города эту технологию на пилотном (полупромышленном) уровне [8, 9].
Целью настоящей работы было исследовать бактерии, осуществляющие анаэробное окисление аммония нитритом в биореакторе, очищающем
сточные воды с высоким содержанием аммония (фильтрат сброженного осадка сточных вод КОС).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение накопительной культуры анаммокс-бактерий проводили в два этапа. 1) Ил со дна реки Москва, отобранный ниже выпусков КОС (500 г), был загружен в анаэробный реактор (50 л), содержащий фильтрат сброженного осадка сточных вод КОС (рН 7—8) с добавлением 70 мг/л N—N02 и 280 мг/л N—NН4 [8]. По мере потребления нитрита его добавляли до исходной концентрации. Через 254 сут началось эквимолярное интенсивное потребление нитрита и аммония. Наращивание биомассы анаммокс-бактерий продолжали в течение последующих 100 сут, после чего культивирование продолжали в проточном реакторе. 2) Полученную на первом этапе биомассу ила (120 г) перенесли в лабораторный проточный реактор периодического действия с полным удержанием биомассы объемом 61 л [8]. В реактор подавали фильтрат сброженного осадка сточных вод КОС (после метанового сбраживания при температуре 55°С) (1—25 л/сут), обработанный в реакторе частичной нитрификации. Фильтрат содержал: N - NH4 - 105 мг/л, - 135 мг/л, N-^3 -
2 мг/л, БПК5 - 18 мг/л, ХПК - 65 мг/л, мольное отношение нитрита и аммония было близко к 1.3, содержание взвешенных веществ не превышало 10 мг/л. В ходе работы реактора нагрузка по азоту возрастала в 13 раз за 200 сут (с 0.01 до 0.13 г азота аммония и нитрита/г беззольного вещества (БВ) биомассы в сут). Через 500 сут работы реактора биомасса была собрана и перенесена в полупромышленную установку объемом 3 м3 [9]. В реакторе обрабатывался частично нитрифицированный фильтрат сброженного осадка состава, аналогичного вышеприведенному, но с содержанием взвешенных веществ до 50 мг/л. Для проведения филогенетических, микроскопических и физиологических исследований, а также определения липидного состава неприкрепленный свободноплавающий активный ил брали непосредственно из лабораторного проточного реактора через 350-400 сут его работы. Для получения биомассы прикрепленного активного ила пленку обрастания соскабливали резиновым скребком со стенок реактора, собирали в колбу, измельчали путем интенсивного встряхивания.
Исследование физиологии анаммокс-бактерий.
Для определения физиологических показателей бактерий, осуществляющих анаэробное окисления аммония (скорости роста, кинетических параметров, оптимумов температуры и рН), применяли стандартные методы. Скорость роста считали пропорциональной скорости потребления аммония и нитрита при их избытке в среде и рас-
считывали при развитии бактерий в лабораторном проточном реакторе с возрастающей нагрузкой по субстрату. Удельные скорости потребления аммония и нитрита, а также их константы полунасыщения Ks рассчитывали по скорости снижения концентраций этих показателей. Опыты проводили в стеклянных флаконах ("Falcon") объемом 100 мл в стандартных условиях (концентрация биомассы составляла 0.9—1.1 г беззольного вещества (БВ)/л). Для предупреждения попадания кислорода в реакционную смесь во время исследований стеклянные емкости наполняли полностью, продували азотом и под током азота плотно закрывали резиновой пробкой. Для каждой экспериментальной точки использовали все содержимое флакона. Исследования проводили при рН 7.8 и температуре 19—22°C. Схема определения оптимумов температуры и рН аналогична. Удельную активность биомассы активного ила выражали в мг азота аммония или нитрита, метаболизированного 1 г БВ активного ила за 1 час (мг N/г БВ активного ила (АИ) ч).
Концентрации компонентов среды определяли стандартными методами: NH4 — фотометрически с реактивом Несслера; NO2 — фотометрически с реактивом Грисса (спектрофотометр DR2010, "Hach", США); взвешенных веществ — гравиметрически (весы AC211S, "Sartorius", Германия); химическое поглощение кислорода (ХПК) — бихроматным методом; биологическое поглощение кислорода (БПК5) — манометрически (в склянках Oxitop, "WTW", Германия) в соответствии с руководством [10].
Морфологию клеток исследовали методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии (эпифлуоресцентный микроскоп Zeiss Axioplan 2, Германия), а также электронной микроскопии (просвечивающий электронный микроскоп JEM-100C, "Jeol", Япония) при напряжении 80 кВ и увеличении х20000). Для электронной микроскопии суспензию активного ила и препараты готовили, как описано ранее [11]. Для визуализации и идентификации анаммокс-бакте-рий использовали метод FISH (fluorescent in situ hybridization) с флуоресцентно мечеными (Су3) олигонуклеотидными зондами Pla46 (общим для всей группы планктомицетов — Planctomycetes) и Amx368 (специфичным для известных анаммокс-бактерий семейства Brocadiaceae) [12, 13]. В работе также использовали зонд Amx148, разработанный нами для новых бактерий, описываемых в настоящей статье.
Определение состава липидов проводили методами газовой и жидкостной хромато-масс-спек-трометрии (ГХ-МС и ВЭЖХ-МС) (газовый хро-мато-масс-спектрометр модели 6890/5975N, "Agilent Technologies", США и жидкостной хромато-масс-спектрометр модели Acella/LTQ Velos,
"Thermo Fisher Scientific", США). Идентификацию веществ проводили с использованием масс-спектральных библиотек NIST08, Wiley8n. Липи-ды из клеток активного ила экстрагировали смесью дихлорметана и метанола (1 : 1) или метил-трет-бутиловым эфиром (МТБЭ) после промывки метанолом. После удаления растворителей упариванием получали метиловые и силильные эфиры жирных кислот [14].
Молекулярно-биологические и филогенетические исследования. Выделение препаратов тотальной ДНК бактериального сообщества активного ила проводили, как это описано ранее [15]. Амплификацию фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, проводили с использованием универсальной праймерной системы Univ11F-Univ1385R [16]. Клонирование полученных ПЦР-фрагментов генов 16S рРНК проводили с использованием набора реактивов pGEM-T Easy system ("Promega", США), согласно рекомендациям производителя, секве-нирование — по методу Сэнгера [17] с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 ("Applied Biosystems, Inc.", США) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730, "Applied Biosystems, Inc.", США. Для проведения кластерного анализа полученные последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы CLUSTAL W [18]. Для построения филогенетиче
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.