МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 1, с. 98-105
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841
НОВАЯ ГАЛОТОЛЕРАНТНАЯ БАКТЕРИЯ ИЗ КРИОПЭГА В ВЕЧНОЙ МЕРЗЛОТЕ: ОПИСАНИЕ PSYCHROBACTER MURIICOLA SP. NOV.
© 2009 г. В. А. Щербакова*' Н. А. Чувильская*, Е. М. Ривкина**, С. А. Печерицына*, С. В. Суетин*, К. С. Лауринавичшс*, А. М. Лысенко***, Д. А. Гиличинский**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино ***Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 31.03.2008 г.
Из линзы соленой воды, находящейся в толще вечномерзлых арктических пород (криопэга) выделена новая галотолерантная психротрофная грамотрицательная бактерия штамм 2pS. Оптимальный рост штамма наблюдали при температуре 16-18°С, максимальная температура роста 37°С, минимальная температура -2°С. Диапазон pH для роста составлял от 5.8 до 8.5 (оптимум 6.5-7.5), солености среды - от 0 до 100 г/л, оптимум при 3-8 г/л NaCl. Штамм 2pS не образовывал кислоту из углеводов и использовал в качестве единственного источника углерода и энергии ацетат, дрожжевой экстракт, пируват, глутарат, фумарат, капроат, гептано-ат, бутират, малат, DL-лактат, цитрат, L-пролин, L-тирозин, бутанол и дульцит. Основными жирными кислотами клеточной стенки при оптимальной температуре роста являются С18 . 1ю7 и С18 . 1ю9. Содержание Г + Ц пар в ДНК составляет 46.0 мол. %. Филогенетический анализ последовательности гена 16S рРНК показал, что исследуемый штамм наиболее близок (97% сходства) к Psychrobacter nivimaris DSM 16093т, га-лотолерантной психротрофной бактерии, выделенной из антарктического морского льда. Генотипиче-ские и фенотипические различия новой бактерии и близкородственных видов позволяют сделать вывод, что штамм 2pS представляет собой новый вид рода Psychrobacter - Psychrobacter muriicola sp. nov.
Ключевые слова. криопэги, Psyhrobacter muriicola, соленость, отрицательная температура.
Род Psychrobacter объединяет строго аэробные хемоорганотрофные, преимущественно психрото-лерантные и галотолерантные, неподвижные грам-отрицательные кокки и коккобациллы. Первый вид этого рода, Psychrobacter immobilis, был изначально описан в 1986 г. [1] на основе группы штаммов, морфологически похожих на Moraxella и Acine-tobacter. Эти штаммы, выделенные из морской воды, чешуи и жабер рыб, были сгруппированы на основании фенотипических признаков и взаимной компетентности к генетичежой трансформации. В дальнейшем, особенно в последние пять лет, было описано много новых видов этого рода, преимущественно из морских и холодных местообитаний [2]. К настоящему времени род включает около 30 видов, объединенных на основе данных филогенетического анализа и общности физиолого-биохими-ческих признаков. Род Psychrobacter на основе данных анализа гена 16S рРНК был отнесен к семейству Moraxellaceae в рамках класса j-Proteo-bacteria [2]. В 2006 г. был секвенирован и проанализирован геном бактерии Psychrobacter arcticus 273-4, выделенной из многолетнемерзлых пород Колымской низменности (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: shcherb@ibpm. pushchino.ru).
query .fcgi?db=gemmeprj&cmd=Retrieve&dopt=Overview& list_uids=9633). Это является большим достижением, поскольку его сравнение с близкородственными мезофильными видами способствует пониманию эволюции холодовой адаптации [3]. О выделении двух штаммов галотолерантных и психротрофных бактерий из арктических криопэгов сообщалось ранее [4, 5].
Целью данной работы является изучение физио-лого-биохимических и фенотипических свойств штамма 2pS для определения его таксономического положения и исследование влияния высокой солености и отрицательной температуры на состав жирных кислот клеточных стенок новой бактерии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Штамм 2pS, выделенный из образцов воды криопэга с минерализацией 170 г/л, стал объектом исследования в настоящей работе. Для сравнительного анализа использовали штаммы микроорганизмов P. immobilis DSM 7229т и P. nivimaris DSM 16093т из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур.
Состав сред и условия культивирования. Для
культивирования штаммов 2pS, P. immobilis DSM 7229т и P. nivimaris DSM 16093т использовали жид-
кую среду следующего состава (г/л): Na2HPO4 - 11.2; KH2PO4 - 4.0; NH4Cl - 2.0; NaCl - 4.0; MgCl2 ■ 6H2O -0.1; CaCl2 - 0.01; FeSO4 ■ 7H2O - 0.005; ацетат натрия - 10.0; раствор микроэлементов SL-10 -10 мл [6].
Исследование влияния температуры, рН и солености на рост штамма проводили, используя минеральную среду, содержащую 20 мМ ацетат. Значения рН от 5.3 до 8.5 получали, используя стерильные растворы 25% (по объему) HCl и 10% (вес/объем) NaHCO3. Влияние температуры на скорость роста изучали при рН 6.9. Влияние солености изучали при росте на среде, содержащей 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 и 6.0% NaCl. При проверке субстратного ряда использовали базовую среду, сахара вносили в количестве 0.2%, остальные субстраты - 0.1%.
Анаэробный рост штамма проверяли в пробирках Хангейта на анаэробно [7] приготовленной минеральной среде с 20 мМ ацетатом.
Для определения энзиматических активностей штамма 2pS использовали коммерческий набор ферментативных экспресс-тестов API ZYM ("BioMerieux", Франция). Тесты проводили согласно инструкциям производителя.
Микроскопические исследования. Морфологию клеток культур изучали с использованием светового микроскопа с фазовым контрастом Люмам И-2 при увеличении 90 х 15, а также электронного микроскопа (JEM-100B, Япония), используя негативно-окрашенные препараты клеток и ультратонкие срезы.
Негативное контрастирование клеток проводили, обрабатывая разбавленную клеточную суспензию 3% раствором фосфорновольфрамовой кислоты, рН 5.0 или 1% раствором молибденовокислого аммония, рН 7.0. Время окрашивания 3-5 мин при комнатной температуре.
Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов проводили как описано ранее [8]. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3 и окрашивали 1%-ным раствором уранил-ацетата.
Окраску по Граму проводили по общепринятой методике.
Выделение ДНК из биомассы было проведено по методу Мармура [9]. Нуклеотидный состав исследовали методом термической денатурации ДНК на спектрофотометре Pye Unicam SP1800 (Великобритания). ДНК/ДНК-гибридизацию определяли методом реассоциации [10].
Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Выделение ДНК проводили по методике, описанной ранее [11]. Амплификацию генов 16S рРНК осуществляли с универсальными праймерами 27f и 1492г на приборе GeneAmp PCR System 2700 ("Applied Biosystems"). Секвенирова-ние амплифицированного фрагмента 16S рДНК
проводили на автоматическом секвенаторе ДНК CEQ2000XL ("Beckman Coulter") с использованием набора секвенирующих реагентов Dye Terminator Cycle Sequencing ("Beckman Coulter") и прилагаемого к набору протокола.
Филогенетический анализ. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК использовали программу ClustalX [12]. Построение бескорневого филогенетического дерева производили с помощью алгоритмов, реализованных в программе TREECON [13].
Анализ жирных кислот. Липиды экстрагировали из клеточной биомассы (3-5 мг сухих клеток) методом кислотного метанолиза в смеси 0.4 мл 1.2 н HCl -метанол при 80°С в течение 1 ч. Метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные компоненты экстрагировали дважды 200 мкл гексана. Экстракт высушивали, обрабатывали 20 мкл ^0-бмс-(триме-тилсилил)-трифторацетамида при 80°С в течение 15 мин для образования триметилсилильных эфи-ров гидроксикислот. Пробу реакционной смеси в 2 мкл анализировали на приборе Шерлок ("MIDI Inc." Delawere, США) в автоматическом режиме. Идентификацию веществ, неоднозначно определяемых по времени удерживания на Шерлоке, производили на системе газовый хроматограф-масс спектрометр AG-5973 ("Agilent Technologies", США). Разделение осуществляли на капиллярной колонке (25 м х 0.25 мм), покрытой химически связанной метилсиликоновой неподвижной фазой HP-5ms Hewlett-Packard (толщина слоя 0.2 мкм).
Хроматографию проводили в режиме программирования температуры от 130 до 320°С со скоростью 5°C/мин. Обработка данных выполнялась с помощью стандартных программ приборов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение. Посев воды криопэга на агаризован-ную среду R2A позволил нам выделить два штамма аэробных бактерий - 1pS и 2pS [4]. Колонии на твердой среде были белого цвета, выпуклые, с ровным краем и диаметром 2-3 мм. Уровень ДНК/ДнК-гибридизации между штаммами 1pS и 2pS составил 89%, на основании чего они могут быть отнесены к одному виду. В дальнейшем подробно был исследован штамм 2pS.
Морфология и ультраструктура. Клетки штамма 2pS представляли собой неподвижные коккоба-циллы шириной 0.5-1.0 мкм и длиной 0.5-2.0 мкм (рис. 1а, 16 ) и окрашивались по Граму отрицательно. Грамотрицательный тип строения клеточной стенки был подтвержден при изучении микрофотографий ультратонких срезов клеток (рис. 1в).
Физиолого-биохимические характеристики. Изо-лят, согласно классификации Морита [14], был пси-хротрофным, так как рос в температурных границах от 5 до 37°С, при оптимуме 16-18°С (рис. 2а). Провер-
' //V •• /У.
I
(а)
••
' (б)
(в)
I_I
Рис. 1. Микрофотографии клеток штамма 2р8: а - фазовый контраст, длина масштабной метки 5 мкм; б - негативное окрашивание, длина масштабной метки 1 мкм; в - ультратонкий срез, длина масштабной метки 0.5 мкм.
ка возможности роста штамма при отрицательный температурах показала, что штамм 2р8 был способен расти при -2°С со временем удвоения 50 ч.
Добавление №С1 в среду культивирования стимулировало рост штамма 2р8. Оптимальный рост наблюдали при концентрации 3-8 г/л №С1. Изолят был толерантен к содержанию до 60 г/л №С1 в среде культивирования (рис. 26) при оптимальной температуре роста. Ранее проведенные нами исследования физиологических особенностей штамма 2р8 показали, что этот обитатель криопэга был способен к росту при содержании №С1 до 100 г/л в среде при температуре -2°С [15].
(а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.