БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 6, с. 682-687
УДК 579.222'152.34,579.84,579.8421/2
НОВАЯ МЕТАЛЛОЭНДОПЕПТИДАЗА МОЯвЛМЕИЛ МОКвЛЛИ ZM © 2014 г. Н. М. Замалютдинова, Л. Ф. Миннуллина, М. Р. Шарипова, А. М. Марданова#
Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18 Поступила в редакцию 05.05.2014 г. Принята к печати 12.05.2014 г.
В клетках Мо^апеПа шощапи /М обнаружили протеолитическую активность, которая ингибирует-ся в присутствии о-фенантролина. Протеазы, содержащиеся в клеточном лизате М. шощапи /М, в отличие от гримелизина, неограниченно расщепляют скелетно-мышечный актин. Зимография с желатином позволила выявить в клетках этих бактерий несколько белков, расщепляющих желатин. Индивидуальная металлоэндопептидаза с молекулярной массой 35 кДа была выделена и очищена из клеточных лизатов М. шо^апи /М с помощью сульфатаммонийного фракционирования и гидрофобной хроматографии.
Ключевые слова: металлоэндопептидаза, Мо^апеНа шощапп, БЬАБТР, выравнивание, очистка.
DOI: 10.7868/S0132342314060153
ВВЕДЕНИЕ
Металлоэндопептидазы (КФ 3.4.24.4.) относятся к одному из самых больших и разнообразных по свойствам классов протеолитических ферментов. Эти ферменты синтезируются различными бактериями и, в том числе, описаны у многих известных патогенов [1—3]. Протеазы могут разрушать структурные компоненты внеклеточного матрикса тканей, расщеплять белки гемостаза, вызывать деструкцию тканей и интоксикацию [4]. Например, в клетках Klebsiella pneumonia описаны две цинкзависимые металлоэндопептида-зы YggG и YpfJ [5, 6]. Гомологи YggG и YpfJ были обнаружены в таких бактериях, как Shigella, Salmonella, Escherichia, Enterobacter и др. Некоторые штаммы Enterobacter sakazakii синтезируют внутриклеточную цинксодержащую металлоэндопептидазу Zpx, вызывающую округление клеток культуры тканей [4]. Бактерии Serratia grimesii, описанные ранее как атипичный штамм Escherichia coli А2 [7], синтезируют цинксодержащую эндопептидазу гримелизин (ранее протеаза ECP32), относящуюся к семейству термолизиноподобных металлоэндопептидаз [8, 9]. Ser. proteamaculans синтезирует металлоэндопеп-тидазу протеализин, представляющую новую группу термолизиноподобных протеаз [10]. Предполагают участие гримелизина и протеализина в инвазии бактерий в клетки эукариот [11, 12].
Сокращение: BLASTP — Basic Local Alignment Search Tool Protein.
# Автор для связи (тел.: +7 (843) 233-78-56; факс: +7 (843) 233-45-68; эл. почта: mardanovaayslu@mail.ru).
Morganella morganii, грамотрицательная бактерия семейства Enterobacteriaceae, является возбудителем оппортунистических и госпитальных инфекций, часто плохо поддающихся лечению из-за устойчивости бактерий к широкому спектру антибиотиков [13, 14].
Настоящая работа посвящена выделению, очистке и характеристике внутриклеточной ме-таллоэндопептидазы M. morganii, расщепляющей актин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Используя референтную последовательность гримелизина Ser. grimesii A2 (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide/163716943) и программу BLASTX (поиск белков с использованием транслированной нуклеотидной последовательности), в геноме M. morganii subsp. morganii KT, штамма близкородственного M. morganii ZM, провели поиск гена, кодирующего термолизиноподобную металлоэндопептидазу. Обнаруженный гипотетический белок состоял из 366 а.о. и относился к семейству М4 нейтральных протеаз суперсемейства глуцинкинов. Молекулярная масса белка (с про-пептидом) составила 41.7 кДа. Молекулярная масса гримелизина Ser. grimesii A2 — 32 кДа [9]. Гипотетическая металлоэндопептидаза M. morganii KT идентична гримелизину Ser. grimesii A2 по аминокислотной последовательности на 37%. Низкое сходство белков M. morganii KT и Ser. grimesii позволяет предположить, что эндопептидазы различаются по структуре и свойствам. Для поиска эндопеп-
НОВАЯ МЕТАЛЛОЭНДОПЕПТИДАЗА MORGANELLA MORGANII ZM
683
тидаз, имеющих более высокое сходство с гипотетической металлоэндопептидазой M. morganii, провели BLASTP-анализ с использованием референтной последовательности YP_007505137.1 (с сервера NCBI). Результаты представлены в таблице.
Гомологи металлоэндопептидазы встречаются в геномах представителей разных родов семейства Enterobacteriaceae (Serratia, Pantoea, Dickeya, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella и некоторых др.). Однако во всех случаях идентичность аминокислотных последовательностей не превышала 37—39%. Наиболее близкими гомологами являются эластаза Ser. marcescens FGI94, протеализин Ser. proteamaculans 568 и внеклеточная металлоэндопептидаза растительного патогена Dickeya dadantii 3937. Протеализин Ser. pro-teamaculans был ранее выделен и детально изучен [10]. Эта эндопептидаза относится к группе тер-молизиноподобных металлоэндопептидаз с коротким ^-сигнальным пептидом.
Выравнивание аминокислотных последовательностей белков-гомологов с последовательностью металлоэндопептидазы (YP_007505137.1) M. morganii KT (рис. 1) показало, что в последовательности гена M. morganii KT присутствуют вставки, отсутствующие в генах других металло-эндопептидаз. В последовательности гипотетической металлоэндопептидазы имелся консервативный мотив HEXXH, входящий в сайт связывания Zn. Однако состав аминокислот в позиции ХХ у металлоэндопептидазы M. morganii KT отличается. ХХ-аминокислотные остатки представлены фенилаланином (F) и серином (S), в то время как в геномах Serratia это — лейцин (L) и аланин (A), а в металлоэндопептидазе Dickeya dadantii 3937 — лейцин и серин.
Для подтверждения синтеза металлоэндопеп-тидазы в клетках M. morganii исследовали протео-литическую активность этих клеток по расщеплению ряда белковых субстратов — азоказеина, актина и желатина. В клетках 24- и 48-часовых культур обнаружили азоказеинрасщепляющую активность. Протеолитическая активность инги-бировалась в присутствии о-фенантролина на 70% и не менялась в присутствии фенилметил-сульфонилфторида — ингибитора сериновых про-теаз. Результаты ингибиторного анализа и активация расщепления азоказеина в присутствии 1 мМ Zn+2 (на 50—60%) позволяют сделать вывод, что в клеточном экстракте M. morganii протеолиз азоказеина обусловлен активностью металлоэндопептидазы. Клеточный экстракт расщеплял скелетно-мышечный актин даже при разведении в 8 раз (рис. 2). Характер расщепления глобулярного актина отличался от гримелизина: протеаза Ser. grimesii А2 расщепляла глобулярный актин в единственном сайте между Gly42 и Val43 с образо-
Гомологи гипотетической металлоэндопептидазы Morganella morganii subsp. morganii KT, найденные в геномах бактерий семейства Enterobacteriaceae
Организм Идентичность, %
M. morganii SC01 96
Ser. marcescens FGI94 39
Dickeya dadantii 3937 39
Ser. proteamaculans 568 37
Ser. grimesii А2 37
Pantoea ananatis LMG 20103 37
Ser. plymuthica 4Rx13 37
Enterobacter sp. SST3 37
Erwinia pyrifoliae Ep1/96 37
Enterobacter cloacae subsp. cloacae 37
ATCC 13047
Citrobacter rodentium ICC168 37
Salmonella enterica 35
Klebsiella oxytoca 36
ванием двух фрагментов массой 36 и 8 кДа [15]. Металлоэндопептидаза M. morganii ZM расщепляла актин неспецифично (рис. 2).
Для того чтобы выявить эндопептидазы, ассоциированные с клетками M. morganii ZM, использовали метод зимографии с желатином в качестве субстрата [19]. Из зимограммы видно, что клеточный экстракт содержал несколько полипептидов с протеолитической активностью (рис. 3).
Для выделения металлоэндопептидазы из клеточного экстракта использовали сульфатаммоний-ное фракционирование. Белки клеточного экстракта последовательно осаждали сульфатом аммония при его насыщении 0—20, 20—50 и 50—70%. В полученных фракциях обнаруживали активность с помощью метода зимографии (рис. 4а). Максимальную активность проявляла фракция, соответствующая 20—50% насыщения сульфатом аммония. Эту белковую фракцию после диализа использовали для гидрофобной хроматографии на колонке с фенил-сефарозой. Белок элюировали понижающимся градиентом сульфата аммония (рис. 5). На рис. 4б представлена зимограмма фракции с активностью, чувствительной к о-фенантролину. На зимограмме видна одна полоса, соответствующая пептиду с молекулярной массой 35 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе зрелого продукта гипотетической металлоэндопептидазы M. morganii.
Таким образом, в клетках бактерий M. morganii идентифицировали металлоэндопептидазу, расщепляющую актин. Фермент ингибировался о-фенантролином — специфическим ингибито-
M. m. KT D. d. 3937
S. m. S. p. S. q.
FGI94
568
A2
10
20 30
40
50
60
70
80
M. m. KT 79 ■п
D. d. 3937 69 f
S. m. FGI94 71
S. p. 568 71
S. q. A2 71
M. m. KT 159
D. d. 3937 141
S. m. FGI94 143
S. p. 568 143
S. q. A2 143
M. m. KT 238
D. d. 3937 216
S. m. FGI94 218
S. p. 568 218
S. q. A2 218
M. m. KT 318
D. d. 3937 292
S. m. FGI94 294
S. p. 568 294
S. q. A2 294
160
170
240 i
IFNPFT]Í(JI\i¡:HELEKGV JES:
Е1ЕИ£ГТ]А1ПЛ<;ВЕ1.АЕ:ЛТЕ£ЕАС EIFNFFT]AIIW:HELaECliTEEEAC EIEmT-nAHWIBElAECVTEEEAC
250
260 I
270
330
340
350
280
ВИ-'. LFCDFEI
gFV----lEs
---1
--1
--С
360
290
300 310 Г
320
DNCCWSSGIPNjaiY, EDNCCVELKSCIPNI U А TKEDHCCTÍELKSCIPNÍAÍ^LJ TKEDNCC\JELESCIPNIAFT¿Li TKEDNCCVELKSCIPHIAÍYLJ
I - - -
370
I----
F LEP--------
Jdtcvlheheqe
Рис. 1. Выравнивание аминокислотной последовательности YP_007505137.1 M. morganii KT относительно последовательностей металлоэндопептидаз бактерий сем. Enterobacteriaceae. M. m. KT — M. morganii KT; S. m. FGI94 — Serratia marcescens FGI94; D. d. 3937 — Dickeya dadantii 3937; S. p. 568 — Serratiaproteamaculans 568; S. g. A2 — Serratia grimesii А2. Консервативный цинксвязывающий мотив HEXXH выделен рамкой.
43 кДа
Рис. 2. Расщепление актина клеточным экстрактом М. тв^апн ZM. (1) — Актин; актин после инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре с клеточными экстрактами без разведения (2) и разведенными в 2 (3), 4 (4), 8 раз (5).
ром металлоэндопептидаз, молекулярная масса составила 35 кДа.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали штамм M. morganii ZM, предоставленный Божокиной Е.С. (Институт Цитологии РАН, Санкт-Пете
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.