КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2015, том 60, № 1, с. 150-157
РОСТ КРИСТАЛЛОВ
УДК 548.55
НОВАЯ НАУЧНАЯ АППАРАТУРА "БЕЛКА" ДЛЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ В УСЛОВИЯХ МИКРОГРАВИТАЦИИ И ЕЕ АПРОБАЦИЯ НА КОСМИЧЕСКОМ АППАРАТЕ "БИОН-М" № 1
© 2015 г. С. С. Баскакова1, С. И. Ковалев1, В. А. Крамаренко1, Л. А. Задорожная1, М. С. Лясникова1, Ю. М. Дымшиц1, В. А. Шишков1, А. В. Егоров3, А. М. Долгин3,
А. Э. Волошин1, М. В. Ковальчук1, 2
1 Институт кристаллографии РАН, Москва E-mail: SvetlBaskakova@yandex.ru 2Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", Москва 3 Центр эксплуатации объектов наземной космической инфраструктуры, Москва Поступила в редакцию 23.04.2014 г.
В апреле—мае 2013 г. проведен космический эксперимент по кристаллизации белков лизоцима и глюкозоизомеразы в устройствах для кристаллизации УК-1 и УК-2 в научной аппаратуре "БЕЛКА" на борту космического аппарата Бион-М № 1. Одновременно в ИК РАН проводился наземный эксперимент. В обоих случаях получены прозрачные кристаллы. Размеры кристаллов лизоцима, выращенных в условиях микрогравитации, превышают их земные аналоги. Оптические исследования кристаллов глюкозоизомеразы, выращенных в космосе, показали, что при срастании одинаково ориентированных кристаллитов образуются квазимонокристаллические блоки. Рентгенодифрак-ционный эксперимент кристаллов лизоцима показал, что разрешающая способность кристаллов, полученных в наземных условиях — 1.74 А, полученных в космическом эксперименте — 1.58 А.
DOI: 10.7868/S002347611501004X
ВВЕДЕНИЕ
На сегодняшний день основным методом изучения структуры белковых молекул с атомным разрешением является рентгеноструктурный анализ монокристаллов исследуемого вещества [1]. При этом точность определения изучаемой атомной структуры напрямую зависит от совершенства используемых монокристаллов. Результаты многочисленных экспериментов свидетельствуют, что выращенные в космосе кристаллы белков имеют более высокое структурное совершенство.
В условиях микрогравитации конвективные потоки практически подавлены и массоперенос в растворе осуществляется главным образом за счет диффузии [2]. Примесь, способная блокировать места изломов и снижать скорость роста, имеет меньшую скорость диффузии, чем молекулы белка, и более высокий коэффициент распределения. В этих условиях концентрация примеси на фронте кристаллизации ниже, и кристалл растет в поле, обедненном примесями.
Первый космический эксперимент (КЭ) проведен в 1981 г. на немецкой ракете ТБХи8. Методом диффузии в жидкости получены кристаллы Р-галоктозидазы и лизоцима. Устройство представляло собой три емкости, разделенные подвижной перегородкой и содержащие буферный, белковый и соляной растворы. Перемещение перегородки способствовало контакту растворов и
диффузии макромолекул и ионов через слой буферного раствора. Ввиду разной плотности растворов возникали трудности с подбором кристаллизационных условий на Земле [3].
В 1983 г. проведена совместная работа Европейского космического агентства и Американского космического агентства NASA по росту кристаллов белков в космосе. Аппаратура была изготовлена на базе устройства, которое использовалось на немецкой ракете TEXUS.
В NASA в апреле 1985 г. впервые в космосе реализовали метод паровой диффузии для роста белковых кристаллов (космический аппарат STS-51D). Устройство кристаллизации включало в себя: шприц с двумя емкостями, заполненными раствором белка и раствором осадителя; пресс, расположенный над шприцом; пористый фитиль, находящийся вокруг шприца и пропитанный раствором осадителя. Однако много образцов было испорчено при активации и дезактивации устройства [4].
В апреле 1988 г. в СССР реализовали первый КЭ по росту кристаллов белков в космосе на беспилотном спутнике "Фотон". Рост осуществлялся методом диффузии в жидкости. Кристаллизационный блок состоял из двух рядов. В первом располагалась 21 ячейка с разными растворами белка, во втором ряду параллельно первому со смещением на 7 см располагались ячейки, содер-
жащие соответствующий раствор осадителя. Сигнал с Земли запускал мотор, который совмещал ячейки друг с другом [5].
Одновременно был запущен китайский спутник "China-23". Аппаратура состояла из гибких пробирок, содержащих растворы белка и осадителя, разделенные воздушным зазором, пережатым до момента попадания в условия микрогравитации (метод паровой диффузии) [4].
В период с 1991 по 1994 г. агентством NASA проведен ряд экспериментов (STS-37, STS-43, STS-49, STS-51, STS-52, STS-57 STS-60) с использованием оборудования, состоящего из нескольких цилиндрических емкостей, в которых реали-зовывался рост в условиях температурного градиента. Основной недостаток — большой объем ростовых пробирок (от 20 до 500 мл), что ограничивало использование дорогостоящих реактивов [6].
Первый полет, основная цель которого — кристаллизация белков в условиях микрогравитации, состоялся в 1992 г. на борту STS-42. Устройства, используемые в данном эксперименте, были те же, что на немецкой ракете TEXUS и американском шатле STS-51D [4].
В 1990 г. на станции Мир проведен ростовой эксперимент в трех разных по конструкции кристаллизаторах. Один из них был подобен устройству, которое использовалось на немецкой ракете TEXUS. Отличие его от первого заключалось в перемешивании растворов, приводимых в контакт после перемещения перегородки. В третьей конструкции реализовывался метод сидячей капли: резервуар с осадителем располагался вокруг резервуара с раствором белка, воздушный контакт между растворами происходил после поднятия мембраны, плотно закрывающей центральный резервуар [7].
В 1995 г. на станции Мир получены кристаллы белков в сосуде Дьюара, в котором раствор белка и раствор осадителя послойно замораживались, а после попадания на станцию размораживались и диффундировали друг в друга. В 1996 г. шатл STS-76 доставил на станцию Мир устройство, в котором диффузия контролировалась введением слоя геля между растворами белка и осадителя [4].
В период с 2001 по 2003 г. проведен целый ряд удачных экспериментов на российском сегменте МКС с использованием уже существующего оборудования [8, 9].
С 2003 г. в ИК РАН реализуется КЭ "Кристаллизатор" по получению кристаллов белков и расшифровке их структуры. В рамках этого эксперимента разработаны устройства Модуль-1 и Мо-дуль-3, позволяющие получать кристаллы белков методами жидкостной и паровой диффузии соответственно. Модуль-1 использовался для проведения КЭ по кристаллизации белков в период с
2003 по 2009 г. на борту Российского сегмента Международной космической станции [10, 11], а Модуль-3 - с 2005 по 2006 г. [12].
Начиная с 2009 г., ИК РАН проводит эксперименты по выращиванию кристаллов белков методом встречной диффузии в капилляре с использованием аппаратуры японского космического агентства JAXA PCG. На МКС в период полетов МКС20-МКС31 выращены кристаллы и расшифрованы структуры ряда белков [13-19].
Космические эксперименты показали как достоинства, так и определенные недостатки всех типов существующих в настоящее время устройств. По результатам проведенных исследований сформулированы и реализованы требования к аппаратуре нового поколения:
— управляемые начало и окончание процесса кристаллизации;
— медленный подъем пересыщения на начальном этапе процесса;
— равномерное или с небольшим градиентом распределение пересыщения по объему раствора.
С учетом перечисленных требований для экспериментов на борту спутника Бион-М № 1 по заказу филиала Центра эксплуатации наземной космической инфраструктуры (ЦЭНКИ) — Научно-исследовательского института стартовых комплексов (НИИСК) разработаны экспериментальные образцы устройств для кристаллизации: УК-1 — выращивание кристаллов белков методом жидкостной диффузии; УК-2 — выращивание кристаллов белков методом паровой диффузии. Оба устройства входят в комплект научной аппаратуры (НА) "БЕЛКА".
Прототипом модуля УК-1 стала НА JAXA. Принципиальное отличие — это возможность автоматического управления началом и окончанием процесса кристаллизации и управления температурным режимом. Прототипом УК-2 стал Мо-дуль-3. Основное отличие УК-2 — возможность автоматического управления температурным режимом.
В апреле—мае 2013 г. проведены КЭ по кристаллизации белков лизоцима и глюкозоизомера-зы в УК-1 и УК-2 в научной аппаратуре "БЕЛКА" на борту космического аппарата Бион-М № 1 и параллельный ему наземный эксперимент.
В данной работе представлены результаты эксперимента в УК-1 и УК-2 научной аппаратуры "БЕЛКА" с уже подобранными в лаборатории ИК РАН условиями кристаллизации и охарактеризовано дифракционное качество кристаллов.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Работа по подбору оптимальных условий для проведения КЭ проводилась в НА "БЕЛКА" в ИК РАН.
Рис. 1. Научная аппаратура "БЕЛКА": блок кристаллизации "БЕЛКА" (а), УК-1 (б), УК-2 (в), система поддержания температуры "БЕЛКА" (г).
Состав НА "БЕЛКА" (рис. 1):
— блок кристаллизации, предназначенный для выращивания кристаллов белков в условиях МГ методом диффузии из жидкостной среды (УК-1) и методом диффузии из газовой среды (УК-2);
— блок, предназначенный для управления работой блока кристаллизации и связи с внешним управляющим компьютером, системой электропитания и радиотелеметрической системой космического аппарата;
— комплект межблочных кабелей.
Устройство кристаллизации УК-1. Принцип проведения экспериментов по кристаллизации белков в модулях кристаллизации (МК) УК-1 проиллюстрирован на рис. 2. В корпусе 1 каждого МК-1 по его периферии расположены пять технологических отверстий. Три из них предназначены для пеналов-держателей капилляров 2 с раствором белка. Размер капилляров 0 1.2 х 0 0.5 х х 40 мм.
Стеклянные капилляры, заправленные раствором белка, помещаются в пеналы-держатели, расположенные в корпусе МК таким образом, чтобы открытый конец каждого капилляра находился в торцевой канавке треугольного сечения, расположенной в крышке МК, при этом противоположный конец капилляра закрывается пробкой, изготовленной из силиконового герметика.
Оставшиеся два отверстия предназначены для специальных шприцов. Один из них 3 — с раствором осад
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.