МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 4, с. 648-657
ГЕНОМИКА. ^^^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.21
НОВАЯ нкРНК Danio гепо: ВЫСОКИЙ УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ И ЯДЕРНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ РНК, ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ С УЧАСТКА, СОДЕРЖАЩЕГО ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ЭЛЕМЕНТЫ
© 2014 г. О. С. Шубернецкая1, Д. А. Скворцов1*, С. А. Евфратов1, М. П. Рубцова1, Е. В. Белова1, О. С. Стрелкова2, В. Д. Черепанинец2, О. А. Жиронкина2, А. М. Оловников3, М. Э. Зверева1, И. И. Киреев2, О. А. Донцова1, 4
Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва 119991 2Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва 119991 3Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Москва 119334 4Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва 119992 Поступила в редакцию 31.01.2014 г. Принята к печати 04.02.2014 г.
Некодирующие и повторяющиеся нуклеотидные последовательности составляют значительную часть генома высших эукариот, однако изучение их функциональной значимости и механизмов действия только начинается. Нами показано, что в геноме Danio гепо внутренние теломерные повторы локализуются вместе с другими повторяющимися элементами, а именно с ИАТ и Еп8рт, широко представленными в геномах позвоночных. Рассмотрение участка генома, содержащего две близкорасположенные пары таких повторов, показало, что эта область транскрипционно активна. В ядрах фибробластов D. гепо выявлены РНК-зависимые структуры, содержащие данную последовательность, что может указывать на функциональную значимость повторяющихся элементов генома или их транскриптов.
Ключевые слова: повторяющиеся элементы генома, некодирующие РНК, организация хроматина, внутренние теломерные повторы, флуоресцентная гибридизация in situ, старение, фибробласты, Danio rerio.
NOVEL ncRNA D. rerio: HIGH LEVEL OF EXPRESSION AND NUCLEAR LOCALIZATION OF RNA, TRANSCRIBED FROM GENOME REGION, CONTAINING REPETITIVE ELEMENTS, by O. S. Shubernetskaya1, D. A. Skvortsov1*, S. A. Evfratov1, M. P. Rubtsova1, E. V. Belova1, O. S. Strelkova2, V. D. Cherepanynets2, O. A. Zhironkina2, A. M. Olovnikov3, M. I. Zvereva1,1.1. Kireev2, O. A. Dontsova1,4 ^Department of Chemistry, Moscow State University, Moscow, 119991 Russia,*e-mail: skvorratd@mail.ru; 2Department of Biology, Moscow State University, Moscow, 119991 Russia; 3Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Moscow State University, Moscow 119991 Russia). The non-coding and repetitive sequences constitute a great amount of higher eukaryotes genomes, but the elucidation of its role and mechanisms of action is now at the very beginning. Here we found, that internal telomeric repeats in Danio rerio are colocalized with some repetitive elements, namely, hAT and EnSpm repeats, which are highly represented in vertebrate genome. While investigating one of genome regions, containing two pairs of such repeats in close proximity we found, that it is transcribed. RNA-dependent structures, containing this sequence, were revealed in D. rerio fibroblast nuclei, which may serve as evidence of functional relevance of repetitive elements in genomes or of their transcripts.
Keywords: repetitive elements, non-coding RNA, chromatin organization, internal telomeric repeats, fluorescence in situ hybridization, aging, Danio rerio, fibroblasts.
Б01: 10.7868/80026898414040132
Повторяющиеся элементы широко представлены в геноме высших эукариот. Они составляют от половины до двух третей генома, в то время как
* Эл. почта: skvorratd@mail.ru
на долю белоккодирующих генов приходится примерно 2%, и еще 5—10% занимают другие элементы с известной функциональной активностью
[1—3]. Повторяющиеся последовательности (повторы) могут участвовать в регуляции экспрессии близлежащих генов, в организации доменов хроматина, а также в поддержании стабильности генома [4]. Среди наиболее хорошо изученных простых повторов можно выделить теломерные повторы, которые формируют протяженные участки на концах хромосом и вместе со специфическими белками и РНК-белковыми комплексами образуют теломеры, необходимые для поддержания стабильности генома [5, 6], Теломеры обозначают концы хромосом как дозволенные разрывы, не нуждающиеся в репарации [7, 8], а специальный механизм их удлинения при помощи теломеразы позволяет решить проблему концевой недоре-пликации ДНК [9], обеспечивая постоянство длины хромосом в ряду поколений [6]. Высокая степень компактизации теломерного гетерохро-матина не препятствует экспрессии РНК, названной TERRA [10], которая участвует в регуляции экспрессии генов, расположенных в прителомер-ных областях [11—13]. Более короткие последовательности, соответствующие теломерным повторам, часто встречаются во внутренних областях хромосом. Их можно подразделить на несколько классов: короткие невырожденные, длинные вырожденные (как правило, субтеломерные) и слитые повторы, у которых два участка, содержащие теломерные повторы, инвертированы друг относительно друга [14]. Свойства и функции внутренних теломерных повторов изучены недостаточно. Предполагается, что часть таких повторов могла возникнуть в ходе эволюции в результате слияния хромосом [15], репарации возникших разрывов теломеразой или ретротранспозиции теломеразной РНК [16, 17].
Существует огромное разнообразие других повторов, многие из которых произошли от мобильных элементов (например, транспозонов), составляющих в геноме человека около половины эухро-матина [2]. Раньше такие последовательности считали "эгоистичными", способными успешно самораспространяться без какой-либо функциональной нагрузки. В последнее время появляется все больше свидетельств их участия в структурировании, поддержании функциональной активности и эволюции генома хозяев [2, 18].
Известно, что между внутренними теломерными повторами могут находиться другие повторяющиеся элементы, например LINE [19], кодирующие РНК [20] (здесь и далее названия семейств и суперсемейств повторяющихся элементов генома соответствуют используемым в базе данных Repbase).
Интересно, располагаются ли вблизи внутренних теломерных повторов другие повторяющиеся элементы, например ДНК-транспозоны [21, 22], в частности, элементы hAT и EnSpm, широко представленные в животном и растительном цар-
стве [21, 23]. Доля суперсемейства hAT, самого распространенного в геноме человека, составляет 1.55% (195 млн.п.н.) [21, 23]. Считается, что эти элементы не активны последние 50 млн. лет [23]. Однако в геноме малой коричневой летучей мыши (Myotis lucifugus) наблюдается заметная экспансия ДНК-транспозонов, включая hAT [24]. Одним из доказательств функциональной значимости таких повторов может служить то, что неавтономный ДНК-транспозон EnSpmN6 участвует в регуляции транскрипции генар53 у D. rerio [25].
Мы предположили, что транскрипция повторяющихся элементов (и внутренних теломерных повторов, в частности) может играть роль в структурной организации соответствующих областей генома, и решили проверить, могут ли внутренние теломерные повторы в сочетании с другими повторяющимися элементами быть функционально значимыми. Мы проанализировали взаимное расположение повторяющихся элементов генома и теломерных повторов, проверили их транскрипционную активность, а также показали, что РНК, транскрибируемая с одного из таких участков, образует кластеры в ядрах фибробла-стов D. rerio.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Биоинформатический анализ. Статистический анализ повторов проводили с использованием базы данных UCSC Repeating Elements by Repeat-Masker для danRer7/Zv9 и GRCh37/hg19 с редукцией имен повторяющихся элементов до их семейств. Собственные базы теломерных повторов построены с помощью программы BLAST по версии сборки генома D. rerio danRer7/Zv9. База данных lincRNA D. rerio сформирована на основе данных [26].
Статистический анализ выполняли средствами BioPerl (http://www.bioperl.org) с использованием базы данных MySQL (Oracle). Каждый элемент интерпретировали как точку с координатой, равной центру элемента. Выбирали окно сканирования (в общем случае по 10000 н. в обе стороны), разбивали его на блоки (обычно по 500 н.) и подсчитывали элементы каждого типа: повторяющиеся элементы по семействам, теломерные повторы, экзоны и интроны генов, lincRNA. Визуализацию результатов анализа окружения выполняли с помощью языка программирования "R" (http://www.r-project.org/).
Выделение РНК D. rerio и обратная транскрипция. РНК из рыб D. rerio выделяли при помощи RNEasy Miniprep Kit ("Qiagen") согласно протоколу фирмы, с последующей обработкой ДНКа-зой I ("Fermentas"). Качество РНК оценивали по сохранности 18S и 28S рРНК, выявляемой электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Обратную
транскрипцию проводили при помощи Reverse transcription kit ("Qiagen") со случайными прай-мерами. Полученную кДНК использовали в ПЦР со специфическими праймерами (табл. 1).
Первичная культура фибробластов D. rerio.
Первичную культуру фибробластов D. rerio получали из плавников взрослых рыб, которые измельчали в растворе Хенкса ("ПанЭко"), промывали 10 раз раствором Хенкса со смесью антибиотиков и антимикотиков ("GIBCO" Anti-Anti, содержащая пенициллин, стрептомицин и фун-гизон), после чего помещали в чашку Петри с питательной средой L15 ("GIBCO") c добавлением 10%-ной фетальной сыворотки крупного рогатого скота и смеси антибиотиков ("GIBCO" 1 xAn-ti-Anti) и инкубировали при 28°С. В течение 1 недели фибробласты мигрировали из плавников и прикреплялись ко дну чашки. Для флуоресцентной гибридизации in situ полученные таким образом фибробласты выращивали на стеклах, покрытых полилизином (стекла выдерживали в течение 1 ч в растворе полилизина (50 мкг/мл), после чего высушивали). Таким же способом получали культуру фибробластов из предварительно механически дехорионизированных двухдневных эмбрионов D. rerio [27]. Проводили морфологическую идентификацию фибробласто
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.