ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 2, с. 194-201
^ ГЕНЕТИКА
РАСТЕНИЙ
УДК 575.11:5792542:582.619
НОВАЯ СИСТЕМА ВЕКТОРОВ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СУПЕРЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ
© 2007 г. Г. В. Погорелко, О. В. Фурсова, О. А. Огаркова, В. А. Тарасов
Институт общей генетики им. НИ. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991; факс: (495)135-43-04; e- mail: gpogorelko@yandex.ru Поступила в редакцию 12.04.2006 г.
Дано описание созданной нами системы двух векторов pEnLox и pCre. Вектор pEnLox предназначен для индукции инсерционных мутаций, а вектор pCre - для получения трансгенных линий растений с экспрессирующимся геном рекомбиназы Cre. Энхансер в составе Т-ДНК плазмидного вектора pEnLox окружен /oxP-сайтами. При скрещивании исследуемого инсерционного мутанта, полученного путем трансформации вектором pEnLox, с другой трансгенной линией Arabidopsis thaliana, несущей ген cre, происходит удаление энхансерной последовательности. Созданная система векторов позволяет индуцировать инсерционные мутации и дифференцировать возможное влияние на мутантный фенотип, которое может быть связано либо с подавлением функции гена при встраивании в него инсер-ции, либо с суперэкспрессией близлежащих генов за счет наличия в структуре инсерции энхансерной последовательности.
Расшифровка полной нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis thaliana в конце 2000 г. позволила реально перейти к решению центральной проблемы молекулярной генетики высших растений - идентификации функции генов. В случае микроорганизмов и животных при определении функциональной значимости отдельных генов широко используется ген-направленный мутагенез, связанный с замещением ин-тактных генов мутантными путем гомологичной рекомбинации [1]. Однако у высших растений такой подход затруднен, если вообще возможен. Это связано с относительно низкой эффективностью гомологичной рекомбинации и, напротив, высокой эффективностью незаконной рекомбинации в соматических клетках [2]. В этой связи основным методом при определении функциональной значимости генов у высших растений, и в первую очередь у A. thaliana, является метод инсерционного мутагенеза [3, 4].
За последние 10-15 лет были разработаны методы для эффективного массового получения инсерционных мутантов A. thaliana [5, 6]. В результате были созданы представительные коллекции мутантных линий A. thaliana, семена которых собраны в коллекционных центрах ABRC (http:// www.arabidopsis.org/abrc/), NASC (http://nasc. nott.aac.uk/) и SALK (http://signal.salk.edu/).
Анализ этих коллекций приводит к тому, что число идентифицированных генов стремительно растет. Если в начале 90-х годов их число исчислялось десятками, то в конце 90-х годов число таких генов составило уже около 1000 [7], а в начале 2005 г. в интернет-базе данных TAIR содержалась
информация о более чем 3500 генов (http://www. arabidopsis.org/info/genefamily/genefamily.html).
Однако большинство созданных коллекций инсерционных мутантов содержат линии, несущие «н/-мутации, которые позволяют изучать функции только стабильно экспрессирующихся в ходе развития растений генов. Это ограничение спектра инсерционных мутаций является осложняющим моментом при исследовании связи между событиями в ДНК хромосом и их фенотипиче-ским выражением. В частности, инсерционные мутации этого типа в генах, функционирующих в экстремальных условиях среды, в норме не приводят к возникновению мутантного фенотипа. В этой связи актуальной является задача расширения спектра мутаций, вызванных инсерцией в геном клеток растений. Этим обусловлен интерес к индукции мутаций другого типа, например мутаций, вызывающих суперэкспрессию генов. Индукция мутаций такого рода достигается с помощью векторов, Т-ДНК которых содержит около одного из бордеров сильный промотор (или энхансер). Инсерция Т-ДНК в этом случае может вызывать увеличение во много раз экспрессии как близлежащих генов, так и (в некоторых случаях) генов, располагающихся за несколько десятков тысяч пар оснований нуклеотидов [8].
Однако когда структура инсерции содержит энхансер, могут возникать мутации двух типов: «н/-мутации, связанные с инактивацией гена при встраивании в него инсерции, и мутации, обусловленные наличием энхансера в структуре инсерции. При массовом получении и анализе инсерционных мутаций, полученных с помощью такого рода векторов, необходимо иметь относительно
Штаммы бактерий и плазмидные векторы, использовавшиеся в работе
Штамм, плазмида Характеристика Источник
Escherichia coli:
JM 109 endAl, recAl, gyrA96, thi, hsdR17 (r-, m+), relAl, supE44, A(lac-pro AB), [F', traD36, proAB, lacqZAM15] Promegа
DH5a q>80dlacZAMl5, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17 (r-, m+), supE44, relAl, deoR, A(lacZYA-argF)Ul69 Promega
Плазмиды:
pGEM7Zf(-) Стандартный вектор для клонирования, lacZ a, ApR Promega
pMLBart Вектор для трансформации растений, SpR [10]
pRH43 Векторная плазмида, ApR, KmR [11]
pQE-32 Стандартный вектор для клонирования Qiagen
pArt7 Источник энхансера - тетрамера промотора 35S рибосомной РНК вируса мозаики цветной капусты [10]
pSKI015 Источник гена bar, обусловливающего резистентность растений к гербициду BASTA [8]
pMDC32 Вектор для трансформации растений [12]
JJ45 Плазмида, несущая ген cre Предоставлена Ф. Рудье, сотрудником группы Ж.-Д. Фауре, лаборатория клеточной биологии Версальского отделения ШЯА, Франция
простую и эффективную систему идентификации «н/-мутаций и мутаций, связанных с суперэкспрессией генов.
Цель данной работы - создание системы, позволяющей идентифицировать мутации, обусловленные наличием энхансера в структуре инсер-ции, встроенной в геном растения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы бактерий и плазмидные векторы, которые использовали в работе, представлены в таблице.
Выделение и очистка ДНК, процедуры молекулярного клонирования и секвенирования, анализ дНк методом ПЦР проводили с помощью стандартных процедур [9] и коммерческих наборов реагентов ("Promega", "Fermentas", "Invitrogen").
В работе использовали следующие антибиотики: ампициллин (Ар) - 100 мкг/мл, канамицин (Km) - 50 мкг/мл, гигромицин (Hyg) - 30 мкг/мл, спектиномицин (Sp) - 50 мкг/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Создание вектора рЕпЬох для получения индуцирующих инсерционных мутаций
Общая схема создания вектора рЕпЬох представлена на рис. 1. В качестве базовой использовали плазмиду рМЬВаП для трансформации растений, несущую ген резистентности к спектино-мицину ^рк) вне Т-ДНК. Фактически полученная плазмида рЕпЬох представляет собой плазмиду рМЬВаП с реконструированной Т-ДНК. На схеме (рис. 1) представлена не вся плазмида, а лишь ее Т-область.
На первом этапе в Т-область плазмиды рМЬВаП встраивали Ара1-ЕсоЫ-фрагмент, несущий ген кшк, окаймленный /охР-сайтами. Этот фрагмент был получен путем клонирования Есо&А-Хко1-фрагмента из плазмиды рЯН43 в полилинкер плазмиды pGEM7Zf(-). Затем из полученной ре-комбинантной плазмиды pGEM7Zf(-) фрагмент, содержащий ген кшК, окаймленный /охР-сайтами, вырезали по сайтам Ара1-ЕсоМ.
Следующий этап заключался в клонировании энхансера в базовую плазмиду рМЬВаП, куда предварительно клонировали ген кшК, окружен-
ЕсоИл тВа81а1* NOS-пpoмoтop АРа1 Есо11 Есо11
Левый бордер Ара1 Ара1 Правый бордер
Т-ДНК плазмиды pMLBart
Левый
Ара1-7
Xh0I ВатН1
рестрикция и лигирование 1охР
по ЕсоИ и Ара1
ВатН1 5ас1
Есо11
loxP
loxP
EcoRI Hindlll
pGEM7Zf(-)
+ kmR kmR
+ 2/охР-сайта
Hindlll
б°РДеР ApaI Hindl11 кт*шВт
i )V II U\
Т-ДНК плазмиды pMLBart + kmR + 2/охР-сайта
pQE32 + энхансер
CaMV35S CaMV35S CaMV35S
CaMV35S Hindlll
рестрикция и лигирование по HindIII и BamHI
ApaI
маннопин-синтетазный -
промотор T7 РНК-полимеразный промотор
ORI
Левый бордер
CaMV35S 1охР
1охРг ту^^^Х3^ \ВашШ! ЕсоИ октопин-синтетазный
\ АР^1 { Правый бордер —р
Левый бордер рестрикция и
НМШ лигирование
Т-ДНК плазмиды pMLBart \по Еро11 и + 21охР-сайта + энхансер
APaI
— pSKl015
ApaI
фрагмент риС19
фрагмент фага Р1 фрагмент риС19
CaMV35S CaMV35S CaMV35S CaMV35S Правый бордер
ApaI
маннопин-синтетазный промотор ApaI
ген устойчивости к гербициду BASTA
октопин-синтетазный терминатор ApaI Левый бордер
CaMV35S
CaMV35S CaMV35S CaMV35S
/охР
Правый бордер
Т-ДНК плазмиды pEnLox
Рис. 1. Схема конструирования вектора pEnLox.
ный /охР-сайтами. Источником энхансера - тетра-мера промотора 35Б рибосомной РНК вируса мозаики цветной капусты - служила плазмида рАй7. Вырезанный из нее по сайтам рестрикции ИтбШ-БаЛ энхансер клонировали в плазмиду pQE-32.
Далее вектор pMLBart, содержащий два /охР-сайта и ген ктк между ними, и вектор pQE-32 со
встроенным в него энхансером рестрицировали ферментами ИтдШ и ВатН1, в результате чего из плазмиды pMLBart был удален ген ктК и вместо него клонирован энхансер, вырезанный из вектора pQE-32 по тем же сайтам. При клонировании в плазмиду pMLBart гена ктК, окруженного /охР-сайтами, из Т-ДНК этой плазмиды удалили ген
маннопин-синтетазный промотор
ген устойчивости к гербициду BASTA CaMV35S
октопин-синтетазный CaMV35S
промотор CaMV35S
левый бордер ^^
правый бордер
ЛЕВЫЙ БOPДEP—
atccgattattctaataaacgctcttttctcttag g It (a cccgccaa ta ta te с tg t с a ai agcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccccaatacgcaaaccgcctct ciad^cgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttccc^
lacgtcgggcccacatacaccaaaaaaatg ctgcataattctcggggcagcaagtcggttacccggccgccgtgctggaccgggttgaatggtgcccgtaacMcggtagagcggacggccaatactcaacttcaaggaatctcacccat gcgcgccggcggggaaccggagttcccttcagtgaacgttattagttcgccgctcggtgtgtcgtagatactagcccctggggcc№tgaaatttgaataagatttatgtaatcagtct№a ggШgaccggttctgccgcttШШaaattggaШgtaataataaaacgcaattgШgШttgtggcgctctatcatagatgtcgctataaacctattcagcacaatatattgtШcatttt aatattgtacatataagtagtagggtacaatcagtaaattgaacggagaatattattcataaaaatacgatagtaacgggtgatatattcattagaatgaaccgaaaccggcggtaaggat
-ТЕРМИНАТОР ОКТОПИН-СИНТАЗЫ
1204 ctgagctacacatgctcaggttttttacaacgtgcacaacagaattgaaagcaaatatcatgcgatcataggcgtctcgcatatctcattaaagcaggactctaggatcgatcccccggg tcatcacatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggtaccggcaggctgaagtccagctgccagaaacccacgtcatgccagttcccgtg
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.