=ЗООЛОГИЯ =
УДК 599.742.21
НОВЫЕ ДАННЫЕ О ФИЛОГЕОГРАФИИ И ГЕНЕТИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ БУРОГО МЕДВЕДЯ Ursus arctos Linnaeus, 1758 СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ ЕВРАЗИИ (АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА КОНТРОЛЬНОГО РЕГИОНА мтДНК)
© 2014 г. В. В. Саломашкина*, М. В. Холодова*, О. Ю. Тютеньков**, Н. С. Москвитина**, Н. Г. Ерохин***
*Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 **Национальный исследовательский томский государственный университет, 634050 Томск, просп. Ленина, 36 ***Институт экологии растений и животных УрО РАН, 620144 Екатеринбург, ул. 8 Марта, 202
E-mail: v-salomashk@yandex.ru Поступила в редакцию 28.01.2013 г.
Проведен анализ полиморфизма фрагмента контрольного региона митохондриальной ДНК 53 образцов тканей бурого медведя Ursus arctos из ряда регионов восточной части России. Установлено, что большинство описанных гаплотипов относятся к наиболее распространенному в Евразии кластеру 3a и не формируют регионально-специфичных гаплогрупп. Однако среди медведей из Западной и Восточной Сибири, а также с о-ва Кунашир выявлено три гаплотипа, близких к гаплогруппе, характерной для медведей Восточного Хоккайдо. Сделано предположение о существовании на территории Восточной Сибири и Дальнего Востока одного или нескольких плейстоценовых рефуги-умов.
DOI: 10.7868/S000233291401010X
Бурый медведь (и^ш аг^вз) — крупный хищник, характеризующийся широким голарктическим ареалом, включающим в себя значительные части Евразии и Северной Америки. Западно-европейский ареал медведя в течение последних столетий подвергся значительному сокращению и сейчас представлен несколькими изолированными популяциями, в то время как в Восточной Европе и России медведь населяет обширные пространства (Барышников, 2007). Для бурого медведя характерна высокая индивидуальная изменчивость морфологических признаков, что вызывает затруднения при выделении подвидов (Гептнер и др., 1967) и установлении степени обособленности и статуса отдельных региональных группировок. Поэтому генетические исследования на внутривидовом уровне представляют особую ценность. В работах по изучению генетической структуры среди хищных млекопитающих Голарктики бурый медведь занимает одно из первых мест.
Результаты генетических исследований, в том числе анализа полиморфизма митохондриальной ДНК (мтДНК), используются для оценки генетического разнообразия и описания филогеографи-ческой структуры вида, реконструкции истории ареала медведей, оценки влияния глобальных климатических изменений и деятельности человека на эти характеристики (ТаЪег1е1 а1, 1998;
Korsten et al., 2009; Davison et al., 2011). Особое значение эти данные имеют для сохранения изолированных и малочисленных популяций этого вида (Taberlet, Bouvet, 1994; Taberlet et al., 1997; Calvignac et al., 2009). Весомый вклад в понимание закономерностей формирования внутривидовой структуры внесли результаты изучения древней ДНК бурых медведей (Leonard et al., 2000; Willerslev, Cooper, 2005; Rohland, Hofreiter, 2007; Calvignac et al., 2009).
Полученные к настоящему времени данные по изменчивости мтДНК позволили выделить в составе вида шесть основных генетических клад. Га-плотипы мтДНК, входящие в первую кладу, встречаются у медведей Западной Европы, во вторую — у бурых медведей островов арх. Александра (ABC-Islands), а также у белых медведей. Наиболее широко на ареале вида представлены гаплотипы третьей клады. Внутри этой клады обычно выделяют два кластера, в которые входят бурые медведи Северной и Восточной Европы, Сибири и Дальнего Востока России, о-ва Хоккайдо, арх. Кодьяк, западной части Аляски и Канады (кластер 3a), а также восточной части Аляски и Канады, о-ва Хоккайдо, Дальнего Востока России (кластер 3b). Гаплотипы мтДНК, входящие в четвертую кладу, описаны для медведей о-ва Хоккайдо, Южной Канады и США. Пятая клада объединяет гаплотипы мтДНК медведей Тибе-
Рис. 1. Места сбора образцов: К — Камчатка (п = 5), и — Свердловская обл. (п = 9), Т — Томская обл. (п = 16), Н — Хакасия и юг Красноярского края (п = 3), Нт — Ханты-Мансийская АО (п = 1), Y — Ямало-Ненецкий АО (п = 2), НК — Хабаровский край (п = 8), СИ — Чукотка (п = 3), М — Магаданская обл. (п = 1), ЕЯ — европейская часть России (п = 3), S — Сахалин (п = 1), Кип — Кунашир (п = 1).
та, шестая — медведей Пакистана и пустыни Гоби (Leonard et al., 2000; Miller et al., 2006; Korsten et al., 2009). Помимо описанных выше шести клад выделяют отдельную группу иранских гаплоти-пов и группу гаплотипов ископаемых медведей с гор Атласа (Северная Африка), филогенетическое положение которых до сих пор неясно (Miller et al., 2006; Calvignac et al., 2008, 2009; Davison et al., 2011). На основании сходства между гапло-типами мтДНК, описанных для разных регионов, было предложено несколько сценариев расселения вида по ареалу в конце плейстоцена—начале голоцена. Однако до сих пор открытым остается вопрос о том, происходила ли последняя, постледниковая волна колонизации из одного ре-фугиума, находящегося на территории Европы, или же существовало несколько альтернативных рефугиумов на территории Сибири или Урала (Korsten et al., 2009; Davison et al., 2011).
Несмотря на множество публикаций по генетическому разнообразию и филогеографии U. arctos, самая многочисленная и географически протяженная популяция медведей восточной части России несравнимо менее изучена, чем популяции из Европы, Северной Америки и Японии (Servheen, 1990; Davison et al., 2011). Между тем увеличение числа исследованных образцов бурого медведя из разных северо-восточных частей Евразии является ключевым для уточнения региональной представленности и структурированности описанных мировых генетических клад, более глубокого изучения закономерностей формирова-
ния пространственного распределения различных генетических линий, обнаружения следов существования гипотетических древних рефугиумов в современной филогеографической структуре вида.
Цель работы — на основании анализа полиморфизма контрольного региона мтДНК оценить генетическое разнообразие бурого медведя северо-восточной части России и уточнить пути формирования филогеографической структуры вида в Евразии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проанализировано 53 образца тканей (кусочки заспиртованных мышц, сухих шкур, зубов и костей) бурого медведя из разных частей евразийского ареала (рис. 1), собранных нашими коллегами во время экспедиционных работ, а также из коллекций Зоомузея МГУ (№ S-177769, S-159008) и Музея ИЭРиЖ УрОРАН (№ 355837; 355119.3; 355839; 355872; 355870; 355871; 355838; 52304; 52300, 452480).
Тотальную ДНК выделяли из мышечных образцов и шкур с использованием набора Diatom DNA Prep 100 (ООО "Лаборатория "Изоген", Москва) согласно инструкции производителя; из костных образцов — с помощью набора QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Германия) по методике Янга с соавт. (Yang et al., 1998). Для анализа был выбран наиболее изменчивый участок мтДНК — контрольный регион. Амплификация
проводилась с помощью праймеров BED1 (прямого, 5'-AGCAACAGCTCCACTACCAG-3') и D4 (обратного, 5'-AGGCATTTTCAGTGCCT-
TGCTTTG-3') (Matsuhashi et al, 1999). Помимо этого для ДНК, полученной из костных образцов, использовались праймеры для амплификации более короткого участка: L1 (прямого, 5'-AGAGTCTTTGTAGTATATTAATTACTTTGG-3') и H674 (обратного, 5'-TGTCCTGTAACCAT-TGACTGA-3') (Рожнов и др., 2010). Полимераз-ная цепная реакция (ПЦР) проводилась согласно протоколам, описанным в этих статьях с использованием набора MasterMixx5 (Диалат, Москва) и Hot Taq-полимеразы (Диалат), очистка продуктов ПЦР — методом осаждения ДНК смесью ацетата аммония и 96%-ного спирта с последующим промыванием 70%-ным этанолом. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США) с применением набора BigDye Terminator v.3.1. (Applied Biosystems) с прямыми и обратными праймерами, использованными при проведении ПЦР.
Выравнивание и редактирование последовательностей проводили вручную в программе Bio-lign (Hall, 2001), анализ данных и реконструкцию филогенетических связей — с помощью программ MEGA 5.1 (Tamura et al., 2011) и Network 4.6.1 (Bandelt et al., 1999). Расчет генетического разнообразия и дистанций выполняли в программах MEGA 5.1 и Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier, Lischer, 2010). Степень родства между медведями из различных региональных группировок оценивали на основании расчета средневзвешенной генетической дистанции (Net distance) в программе MEGA 5.1. Для построения филогенетических деревьев в программе MEGA 5.1 были использованы алгоритмы ближайшего связывания (Neighbor-Joining (NJ)) и максимального правдоподобия (Maximum likelihood (ML)) с эволюционной моделью Tamu-ra-Nei. у-дистанция вычислялась отдельно для каждой выборки в программе MEGA 5.1 перед построением дерева. Для вычисления генетической дистанции и внутригрупповой изменчивости также использовалась модель Tamura-Nei. Для сравнительного анализа в исследование были включены представленные в международной базе GenBank (ncbi.nlm.nih.gov) гомологичные последовательности бурого медведя: EU526765— EU526814 (Korsten et al., 2009), AB013040-AB013070 (Matsuhashi et al., 1999), FN292970-FN292982 (Calvignac et al., 2009), X75862-X75866, X75868, X75877, X75878 (Taberlet, Bouvet, 1994), AB010725—AB010728 (Masuda et al., 1998), DQ914292-DQ914294, DQ914296-DQ914298, DQ914308, DQ914330, DQ914409-DQ914410, EF033869-EF033874, EF033893, EF033895 (Miller et al., 2006). В качестве внешней группы при построении филогенетических деревьев использо-
вали размещенные гомологичные последовательности гималайского медведя и^т Л1Ьв1апиз (АВ-101525) и американского черного медведя и^ш ашвпеапш (N^003426.1).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Длина полученного фрагмента контрольного региона мтДНК составила 763 п.н., однако в ряде случаев успешно амплифицировать удалось только более короткие фрагменты (700 или 571 п.н). Поэтому при анализе были сформированы две выборки, одна из которых включала в себя 40 последовательностей длиной 763 п.н., а другая — 53 последовательности длиной 571 п.н.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.