МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № б, с. 843-847
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 641.46:582.23.017.64
НОВЫЕ ДАННЫЕ О РАСПРОСТРАНЕНИИ НЕКОТОРЫХ ПСИХРОФИЛЬНЫХ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ В МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ
© 2010 г. А. В. Качалкин1
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения
Поступила в редакцию 04.03.2010 г.
Со сфагновых мхов и болотных сосудистых растений Московской области выделено несколько редких видов и разновидностей психрофильных дрожжевых грибов. По нуклеотидным последовательностям региона D1/D2 26S рДНК они были отнесены к видам: Sterigmatosporidium polymorphum, Rhodotorula psychrophenolica и Aureobasidiumpullulans var. subglaciale. Таким образом, обнаружено новое местообитание S. polymorphum, и впервые в средней полосе России выделены дрожжевые грибы, распространение которых прежде отмечалось только для Альп и арктического региона.
Ключевые слова: психрофильные дрожжи, Sterigmatosporidium polymorphum, Rhodotorula psychrophenolica, Aureobasidium pullulans, 26S рДНК.
Часто приуроченность некоторых редких видов микроорганизмов, после их первых или нескольких повторных выделений, начинают связывать только с соответствующими регионами выделений: Арктика, Антарктика, высокогорья и пр. Однако бывает, что редкие и "локально распространенные" виды можно обнаружить и в схожих природных местообитаниях, но достаточно географически разделенных.
Растения и растительные остатки являются основным природным местообитанием большинства видов дрожжевых грибов. Многочисленные и разнообразные дрожжевые сообщества формируются на поверхности живых частей растений [1, 2]. Сфагновые мхи и болотные сосудистые растения, благодаря своим особым физиологическим свойствам и особым условиям произрастания, представляются интересным, но пока малоизученным природным местообитанием эпифитных дрожжевых грибов. Роль сфагновых мхов и болотных сосудистых растений в формировании дрожжевых сообществ заключается в изменении питательного режима: "недостатке азота и микроэлементов, а также, для сфагновых мхов, в значительном присутствии в экссудатах органических кислот", и пониженной температуры в сфагновой дернине [3].
В результате проводимого нами круглогодичного исследования эпифитного дрожжевого сообщества сфагновых мхов и болотных сосудистых растений на одном из верховых болот Московской области было выделено несколько видов психрофильных (по их максимальной температуре роста [4]) дрожжевых грибов: Sterigmatosporidium polymorphum Kraepelin et Schulze, Rhodotorula psychrophenolica Margesin et al.,
1 Адрес для корреспонденции (e-mail: soilyeast@mail.ru).
Aureobasidium pullulans var. subglaciale Zalar, de Hoog et Gunde-Cimerman.
Таким образом, в ходе данной работы было обнаружено новое местообитание для редких видов дрожжевых грибов, и впервые в средней полосе России были выделены дрожжевые грибы, распространение которых прежде отмечалось только для Альп и арктического региона.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Образцы сфагновых мхов (Sphagnum magellanicum Brid., Sph. angustifolium (Russ.) C. Jens.) и болотных сосудистых растений (Oxycoccus palustris Pers., Carex limosa L., Chamaedaphne calyculata L., Drosera rotundi-folia L.) отбирались ежемесячно с мая 2008 г. по май 2009 г. с Куровского верхового болота (Московская обл., Пушкинский р-н). При этом отдельно анализировали две части растения: наземную и расположенную в толще моховой дернины. Отбор образцов для каждой части растения ежемесячно производился в трех удаленных точках болотного массива в двух повторностях для каждой точки, находящихся на расстоянии 5—10 м. Из каждого образца брали 3 навески, анализировавшиеся по отдельности.
Численность и таксономический состав дрожжей анализировали стандартным методом посева на глюкозо-пептонно-дрожжевой среде (GPYA), подкисленной молочной кислотой (рН 4—4.5) для подавления роста бактерий; для подавления роста ми-целиальных грибов посевы культивировали при 10°С в течение 1 месяца [5]. Культуры дрожжей идентифицировали по некоторым морфологическим признакам, используя определитель [б] и с помощью анализа нуклеотидных последовательностей D1/D2 региона 26S (LSU) рДНК.
844
КАЧАЛКИН
66
AF075516 Kockovaella thailandica CBS 7552
92
_100 LAF189862 Kockovaella imperatae CBS 7554
—AF363650 Kockovaella sacchari CBS 8624
-AB292854 Kockovaella barringtoniae JCM 10998
— AF075506 Fellomyces fuzhouensis CBS 6133
67
100
CBS 9644 Cuniculitrema polymorpha AY032662 Cuniculitrema polymorpha — AF075480 Sterigmatosporidiumpolymorphum CBS 8088 CBS 8089 Sterigmatosporidium polymorphum KBP 3863 KBP 3864 KBP 3865
_AF042235 Tremella foliacea CCJ 1396
0.01
Рис. 1. Филогенетическое положение выделенных штаммов Sterigmatosporidium polymorphum. Tremella foliacea — внешняя группа.
Амплификацию D1/D2 региона 26S рДНК [7] проводили по описанной ранее методике [3] непосредственно из дрожжевой биомассы с использованием праймеров ITSlf (5'-CTTGGTCATTTAGAG-GAAGTA), NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG) и смеси для ПЦР ScreenMix (ЗАО "Евроген", Москва). Очистку ПЦР-продукта проводили с использованием набора BigDye XTerminator Purification Kit ('Applied Biosystems", США). Для секвени-рования использовали праймер NL4. Секвенирова-ние ДНК проводили с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit ("Applied Biosystems", США) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer в Научно-производственной компании "Синтол" (Москва). Для филогенетического анализа полученных результатов использовали пакет программ MAFFT 6 [8] и MEGA4 [9]. Си-квенсы для построения филогенетических деревьев были использованы по материалам статей с описаниями из генбанка NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/) и CBS (http://www.cbs.knaw.nl/). Филогенетические положения выделенных штаммов (рис. 1—3) получены методом Neighbor-Joining. Номера, данные над разветвлениями, соответствуют частоте (>55%) соединения таксонов при 1000 построений. Шкалы показывает число замен на каждый нуклеотид.
Исследованные штаммы депонированы в коллекцию дрожжевых грибов кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, полученные сиквенсы помещены в ген-банк ^В1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе нашего исследования было выделено 9 штаммов дрожжевых грибов Sterigmatosporidium polymorphum, образующие на клетках несколько сте-ригмато-конидий. Температурные пределы роста выделенных штаммов находятся в границах 4— 6... 18—22°С. Все выделения были сделаны только с частей растений, находящихся в воде; на наземных частях растений и растениях под снегом подобные дрожжевые грибы обнаружены не были. Доминирование данных грибов в эпифитном дрожжевом сообществе наблюдалось только однократно, в январе 2009 г., при анализе корневищ C. limosa и нижних частей стеблей, погруженных подо льдом в воду. Периоды выделений, субстраты и показатели обилия S. polymorphum для каждого субстрата представлены в таблице. Перерывы между периодами выделений, разные субстраты, с которых происходили выделения, показывают сильную локальность распространения и непостоянство во встречаемости для группировок данного вида дрожжевых грибов на территории болотного массива.
НОВЫЕ ДАННЫЕ О РАСПРОСТРАНЕНИИ НЕКОТОРЫХ ПСИХРОФИЛЬНЫХ
845
85
58
83-
73
90
63
80
55
84
EF151258 Rhodotorula glacialis CBS 10436 EF643729 Rhodotorula glacialis DBVPG 4779 EF643732 Rhodotorula glacialis DBVPG 4784 L- EF643740 Rhodotorula glacialis DBVPG 4797 EF151252 Rhodotorulapsychrophila CBS 10440 EF151254 Rhodotorula psychrophila CBS 10439 L AM235744 Rhodotorula sp. Rup1B — AY745728 Kriegeria eriophori CBS 101449 FN550378 Rhodotorula psychrophenolica r- KBP 3870 KBP 3868
EF643739 Rhodotorula psychrophenolica DBVPG 4796 EF151255 Rhodotorula psychrophenolica CBS 10438 EF643738 Rhodotorula psychrophenolica DBVPG 4795 KBP 3869
EF643736 Rhodotorula psychrophenolica DBVPG 4792 EU872490 Rhodotorula rosulata CBS 10977 " EF370394 Microbotryomycetidae sp. CSDX3-Y8
0.02
Рис. 2. Филогенетическое положение выделенных штаммов Rhodotorula psychrophenolica. Rhodotorula minuta CBS 319 (AF189945) — скрытая внешняя группа.
77 58
97
KBP 3866
FJ150913 Aureobasidiumpullulans var. subglaciale CBS 123387 FJ150938 Aureobasidium pullulans var. subglaciale CBS 123386 -FJ150937 Aureobasidium pullulans var. namibiae CBS 147.97
98
99
FJ150926 Aureobasidium pullulans var. melanogenum CBS 105.22 FJ150921 Aureobasidium pullulans var. melanogenum CBS 621.80 FJ150942 Aureobasidium pullulans var. pullulans CBS 584.75 FJ150947 Aureobasidium pullulans var. pullulans CBS 122385 -FJ150912 Sydowiapolyspora CBS 750.71
0.005
Рис. 3. Филогенетическое положение выделенных штаммов Aureobasidium pullulans var. subglaciale. Sydowia polyspora внешняя группа.
846 КАЧАЛКИН
Периоды выделений, субстраты и показатели обилия для исследуемых видов дрожжевых грибов
Вид дрожжевых грибов Период выделения Субстрат Обилие (%)/частота встречаемости (%)
S. polymorphum Май 2008 г. Sphagnum spp. (нижняя часть) 1.8/8.7
Ноябрь 2008 г. C. calyculata (нижняя часть) 14.3/11.1
Январь 2009 г. C. limosa (нижняя часть) 98.3/88.9
R. psychrophenolica Апрель 2009 г. Sphagnum spp. (верхняя часть) 10.2/29.3
Апрель 2009 г. C. limosa (верхняя часть) 76.8/33.3
Апрель 2009 г. O. palustris 11.4/33.3
A. pullulans var. subglaciale Май 2008 г.-май 2009 г. Со всех растений 16.8/30.7
Для полученных нами нуклеотидных последовательностей D1/D2 региона 26S рДНК для трех выделенных штаммов (KBP 3864 (FN554715), KBP 3865 (FN554716), KBP 3863 (FN554714)) был проведен филогенетический анализ (рис. 1). Полученные результаты показали конспецифичность исследуемых нами штаммов с S. polymorphum CBS 8089. Культивирование на средах, используемых для образования мицелия [5], не позволило обнаружить у исследуемых культур каких-либо телеоморфных структур.
S. polymorphum — диморфные тремелловые грибы, в дрожжевой стадии образующие несколько конидий (почек) на выростах клетки (стеригмах). Дрожжи данного вида были описаны в конце 70-х годов после
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.