научная статья по теме НОВЫЕ ФАКТОРЫ РЕГУЛЯЦИИ МАГНИЙ-ХЕЛАТАЗЫ У ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ CHLAMYDOMONAS REINHARDTII Биология

Текст научной статьи на тему «НОВЫЕ ФАКТОРЫ РЕГУЛЯЦИИ МАГНИЙ-ХЕЛАТАЗЫ У ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ CHLAMYDOMONAS REINHARDTII»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 2, с. 187-196

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

НОВЫЕ ФАКТОРЫ РЕГУЛЯЦИИ МАГНИЙ-ХЕЛАТАЗЫ У ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ СМатуиотопа8 геткагйги © 2014 г. Е. М. Чекунова*, |Е. Б. Яронская **, Н. В. Ярцева*, Н. Г. Аверина*

*Кафедра генетики и биотехнологии биолого-почвенного факультета, Санкт-Петербургский государственный

университет, Санкт-Петербург **Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси, Минск, Беларусь

Поступила в редакцию 11.02.2013 г.

Зеленая одноклеточная водоросль хламидомонада Chamydomonas гвткаМШ в отличие от высших растений, синтезирующих хлорофилл (Хл) только на свету, образует его и в темноте. Методами биохимии и генетики изучали механизмы темнового биосинтеза Хл на модели пигментных мутантов С. reinhardtii по гену ЬТ83, кодирующему фактор транскрипционной регуляции генов ключевого фермента биосинтеза Хл магний-хелатазы (МХ), их ревертантов и обратных мутантов. Клетки /йЗ-мутантов в темноте накапливают субстрат МХ - протопорфирин IX и формируют оранжевые колонии, которые на свету зеленеют. Их фенотип оказался обусловлен снижением в условиях гетеротрофного роста активности МХ. Результатом исследования супрессии /йЗ-мутаций стало обнаружение двух новых ядерных генов С. reinhardtii: 8иР-3 и 8иР-1, кодирующих факторы регуляции активности МХ. 8иР-3 сцеплен с ЬТ83 и кодирует белок-репрессор альтернативного ЕГ83 пути регуляции МХ. Молекулярная идентификация гена 8иР-1 позволила предположить, что его продукт является компонентом ЕГ$3-пути, контролирует процесс зеленения и регулирует МХ на посттрансляционном уровне.

Ключевые слова: Ch/amydomonas reinhardtii — хлорофиллы — магний-хелатаза — факторы регуляции

БОТ: 10.7868/80015330314020031

ВВЕДЕНИЕ

Хлорофиллы (Хл) — уникальные природные тетрапирролы, играющие ключевую роль не только в жизни фотосинтезирующих организмов, но и всей биосферы. Их метаболизм связан с морфогенезом растительной клетки и реакциями фотосинтеза — запасанием и преобразованием энергии света. Важнейшая фундаментальная проблема современной биологической науки состоит в понимании природы процессов формирования и функционирования молекул Хл, механизмов их генетической и биохимической регуляции, а также закономерностей изменений, которые они претерпели в ходе эволюции и при адаптации к различным экологическим условиям.

Сокращения: АЛК - 5-аминолевулиновая кислота, МХ — магний-хелатаза, М^ПП — магний-протопорфирин IX, М^ПП(Э) — магний-протопорфирин IX и его монометиловый эфир, ОРС — открытая рамка считывания, ПП — протопорфирин IX, Пд — протохлорофиллид, Хд — хлорофиллид, Хл — хлорофилл.

Адрес для корреспонденции: Чекунова Елена Михайловна. 199034 Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9. Санкт-Петербургский государственный университет. Факс: (812)-428-77-33; электронная почта: elena_chekunova@mail.ru

Биосинтез функциональных тетрапирролов в фотосинтезирующей клетке (рис. 1) начинается с образования из глутамата 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК), которая через серию энзимати-ческих реакций превращается в протопорфирин IX (ПП) — общий предшественник гема и Хл [1]. Первый специфический фермент биосинтеза Хл — магний-хелатаза (МХ) — обеспечивает превращение ПП в магний-протопорфирин IX (М§ПП), и представляет собой комплекс, состоящий из трех субъединиц: СНЫ, СНЬЭ и СНЬН. Помимо выполнения ферментативных функций, а именно встраивания М§2+ в молекулу ПП, большая субъединица МХ (СНЬН) участвует в передаче сигналов от хлоропласта к ядру, задействована в транскрипционной регуляции и является компонентом путей гормонального и редокс-контро-ля [2]. Метилирование М§ПП и формирование циклопентанонового кольца завершаются последовательным образованием протохлорофиллида (Пд), хлорофиллида (Хд) и Хл.

До недавнего времени полагали, что способность растений и фототрофных микроорганизмов синтезировать Хл на свету и в темноте зави-

187

3*

Глутамат

5-АЛК

Гем

trnE GTR GSA

ALAD CPX PPX

темнота

Mg-протопорфирин монометиловый эфир

I

Протохлорофиллид

chlB chlL chlN

yellow------Pc-1

темнота

POR

Хлорофиллид

I

Хлорофилл a \

Хлорофилл b

CAO

Рис. 1. Генетический контроль биосинтеза хлорофилла у C. reinhardtii.

На схеме строчными буквами указаны мутации, блокирующие отдельные этапы биосинтеза Хл. Заглавными буквами обозначены ядерные гены ферментов биосинтеза Хл: GTR — глутамил-тРНК-редуктазы; GSA — глутамат- 1-полуальдегид-аминотрансферазы; ALAD — АЛК-дегидратазы; CPX — копропорфирино-ген III-оксидазы; PPX — протопорфириноген IX-ок-сидазы; субъединиц магний-хелатазы: CHLH, CHLD, CHLI; POR — светозависимой НАДФ: протохлоро-филлид-оксидоредуктазы (сПОР); CAO — хлоро-филл/хлорофиллид-оксидоредуктазы. Хлоропласт-ные гены: trnE кодирует глутаминовую тРНК, а гены: chlB, chlL и chlN — субъединицы тПОР. В овалах - мутации, ведущие к структурным и регуляторным нарушениям МХ.

сит только от наличия двух ферментных систем, обеспечивающих превращение Пд в Хд. Светоза-висимый катализ осуществляет НАДФ:Пд-окси-доредуктаза (сПОР), находящаяся под контролем ядерного генома. Темновую реакцию катализирует ферментный комплекс тПОР, субъединицы которого кодируют 3 гена хлоропласта: еМВ, еНШ и еМЬ, ведущие свое происхождение от нитрогеназ эубактерий [3, 4]. В процессе эволюции высшие растения утратили тПОР, а более древние фото-

синтетики, к числу которых принадлежит одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas (C.) reinhardtii — модельный объект генетики фотосинтеза [5], сохранили способность синтезировать Хл в темноте, используя в качестве источника углерода ацетат натрия. Таким образом, независимое от света восстановление Пд у хламидомонады осуществляют продукты трех хлоропластных генов, кодирующих тПОР, и не менее восьми ядерных генов, функции которых до сих пор не ясны [6, 7]. Мутации в этих генах блокируют способность синтезировать Хл в темноте и обусловливают "yellow" фенотип, - бес-хлорофильные клетки водоросли, подобно этиолированным проросткам высших растений накапливают Пд, и, благодаря каротиноидам, формируют желтые колонии, зеленеющие на свету.

Для выяснения роли фермента МХ в регуляции биосинтеза Хл у хламидомонады наиболее продуктивным оказался генетический подход. Исследования бесхлорофильных оранжевых мутантов C. reinhardtii, накапливающих в темноте субстрат МХ — ПП [8, 9], позволили идентифицировать 2 ядерных гена: CHLH и LTS3, блокирование которых ведет к этому фенотипу [10, 11]. Мутации в гене CHLH (brs-1 и chll) вызывали гибель клеток при освещении. Дальнейшие исследования показали, что ген CHLH C. reinhardtii кодирует большую субъединицу МХ [12]. Клетки водоросли, несущие аллельные мутации (brc-1 и lts3) в гене LTS3 в темноте также накапливали более ранние, чем Пд, красные предшественники Хл — ПП и М§ПП, и формировали колонии оранжевого цвета, но сохраняли способность зеленеть на свету. Фенотип Йу3-мутантов свидетельствовал о наличии независимого от Пд контроля темнового биосинтеза Хл. Молекулярная идентификация и анализ структуры гена LTS3 показали, что он кодирует ДНК-связывающий белок семейства GATA, позволив предположить, что белок LTS3 является фактором транскрипции, активирующим экспрессию генов МХ в гетеротрофных условиях роста [13]. Это означало, что у C. rein-hardtii регуляция темнового биосинтеза Хл осуществляется не только на этапе превращения Пд, но и на более ранней стадии синтеза пигмента — путем транскрипционной регуляции генов МХ.

Значительный интерес представлял поиск других компонентов регуляторной машины клетки C. reinhardtii, обеспечивающих темновой синтез Хл в условиях отсутствия функционального белка LTS3. Одним из подходов к поиску альтернативных путей регуляции является изучение супрессии мутантных признаков. Целью работы стало выяснение молекулярно-генетических механизмов регуляции светонезависимого биосинтеза Хл

свет

у одноклеточной водоросли C. reinhardtii, а предметом исследования - спонтанный ревертант и обратный мутант, полученные от пигментных мутантов по гену LTS3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Клетки штаммов Chlamydomonas reinhardtii дикого типа СС124 (генотипа: wt) и мутантов по гену LTS3: Brc-1 (генотипа: brc-1, mt+), Brc3 (генотипа: brc-1, mt-) и ре-вертанта Brc-8 (генотипа: brc-1, arg7, sup-3, mt+) были получены из Петергофской генетической коллекции [14] и из коллекции генетического центра хламидомонады [15]. Клетки выращивали на средах ТАР (от Tris-Acetate-Phosphate) и Т (ТАР без добавления ацетата) в жидкой культуре или на чашках Петри (1.5% агара) при температуре 24°С в темноте или на белом свету средней интенсивности (12 Вт/м2).

Гибридологический анализ. Скрещивания и анализ потомства зигот проводили по методу Столбовой [8]. Генетические расстояния между маркерами (D) определяли по результатам тетрадного анализа в сантиморганах (сМ) по формуле:

D = (N + 0.5T)/(P + N + T) х 100,

где P, N, T — родительский дитип, неродительский дитип и тетратип соответственно.

Содержание пигментов в клетках C. reinhardtii.

Хлорофиллы извлекали 80% ацетоном и определяли их содержание в растворе по оптической плотности при длинах волн 649 и 665 нм [16]. Для определения содержания предшественников Хл — ПП и его магниевых производных, пигменты экстрагировали смесью ацетон: 0.1 N NH4OH (9 : 1, по объему), и, добавляя гексан, разделяли их на растворимые в гексане фитольные формы и на бесфитольные, остающиеся в водно-ацетоновой фазе. Количество ПП, М§ПП(Э), Пд, и Хд в отмытых гексаном водно-ацетоновых экстрактах определяли спектрофлуориметрически. Флуоресценцию ПП и М§ПП(Э) регистрировали при X = = 633 и 595 нм, используя длины волн возбуждения флуоресценции 405 и 420 нм соответственно. Для Пд и Хд а длина волны возбуждения флуоресценции составляла 450 нм, а регистрацию флуоресценции проводили при X = 636 нм и X = 670 нм соответственно [17].

Определение активности МХ. Клетки C. reinhardtii инкубировали в 0.2 мл буфера (0.5 М сор-битол, 50 мМ трицин, 1 мМ ДТТ, 10 мМ MgCl2, рН 7.8), содержащего 3.5 мкМ ПП (раствор в ди-метилсульфоксиде, 2% по объему) и 4 мМ MgATФ в регенери

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком