УДК 579.254.2,582.282.123.2,544.473:577.15
НОВЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ С ВЫСОКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПЕКТИНАЗ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ Pénicillium canescens
© 2015 г. Е. А. Рубцова*, Е. В. Бушина*, А. М. Рожкова*, О. Г. Короткова*, В. А. Немашкалов**, А. В. Кошелев**, А. П. Синицын* ***
* Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, 142290 ***Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, 119991
e-mail: Katrintz@mail.ru Поступила в редакцию 11.02.2015 г.
Методами генетической инженерии были получены рекомбинантные штаммы Pénicillium canescens, которые продуцировали гомологичную пектинлиазу А и гетерологичные эндо-1,5-а-арабиназу А и эндо-1,4-а-полигалактуроназу, а также ферменты исходного штамма (a-L-арабинофуранозидазы, ксиланазы и другие ферменты). Ферментные препараты (ФП), полученные из культуральной жидкости этих штаммов P. canescens, эффективно гидролизовали растительное сырье с высоким содержанием пектиновых веществ. Показано, что при гидролизе свекловичного жома одним из полученных ФП выход восстанавливающих сахаров и арабинозы повышался на 16 и 22% по сравнению с контрольным ФП на основе исходного штамма. Установлено, что в состав наиболее активного ФП входили пектин-лиаза (10%), эндо-1,5-а-арабиназа (26%), a-L-арабинофуранозидаза и арабиноксилан-арабинофура-ногидролаза (12%) и ксиланаза А (10%). Определены активности пектинлиазы, полигалактуроназы и арабиназы ФП по отношению к различным субстратам. Изучены специфичность, оптимум рН и температуры, термостабильность гомогенной рекомбинантной эндо-1,5-а-арабиназы. Определены ее кинетические параметры (Km, kcat) гидролиза линейного арабинана.
Ключевые слова: арабиназа, пектинлиаза, полигалактуроназа, Penicillium canescens. DOI: 10.7868/S0555109915050141
В состав полисахаридов клеточной стенки растений входят целлюлоза, гемицеллюлозы и пектиновые вещества. Гемицеллюлозы составляют около 20% (по сухой массе) клеточной стенки растений, а содержание пектиновых веществ может достигать 5—12% [1]. Функциональная роль гемицеллюлоз заключается в том, чтобы обеспечивать взаимосвязь основных компонентов клеточной стенки, в частности, пектиновые вещества и целлюлоза связываются арабинанами и арабиногалактанами [2]. Одним из основных этапов переработки растительного сырья является превращение сложных полисахаридов клеточной стенки растений в простые сахара. При ферментативном гидролизе целлюлаз и гемицеллюлаз пектиновые вещества затрудняют доступ к волокнам соответствующих полисахаридов, особенно при гидролизе полисахаридов в растительных тканях с их высоким содержанием (отходы переработки сахарной свеклы, соевый, подсолнечный и рапсовый шрот, рисовые отруби, арахис, отходы переработки цитрусовых и т.д.) [3]. Комплекс ферментов (помимо целлюлаз), обеспечивающих гидролиз целлюлозы, должен также содержать пектиназы и гемицеллюлазы, которые повышают
эффективность гидролиза вследствие разрушения пектиновых веществ и гемицеллюлоз.
Мицелиальный гриб Penicillium canescens секре-тирует комплекс внеклеточных ферментов, состоящий в основном из эндо-1,4-Р-ксиланазы, араби-ноксилан-арабинофураногидролазы, a-L-араби-нофуранозидазы и Р-галактозидазы [4, 5]. Однако пектолитические ферменты в нем присутствуют в незначительных количествах, и кроме того гриб P. canescens не секретирует арабиназу, являющуюся одним из ключевых ферментов, гидролизующих арабинаны [6].
Цель работы — создание продуцентов комплекса карбогидраз (пектиназ, арабиназ и ксиланаз) на основе гриба P. canescens и получение ФП для ферментативной конверсии растительного сырья.
МЕТОДИКА
Реагенты. Для проведения электрофореза в ПААГ использовали буферные системы и реактивы фирм "BioRad" (США), "MP Biomedicals Inc." (Франция) и "Реахим" (Россия), а также кумасси бриллиантовый синий R-250 ("Helicon", Россия) и a-L-арабинозу ("Merck", Германия). В качестве
антибактериальных агентов при гидролизе свекловичного жома применяли NaN3 ("Helicon", Россия) и смесь ампициллина и оксаллицина "Ампи-окс" ("Брынцалов-А", Россия).
Субстраты. Арабинан сахарной свеклы (линейный и разветвленный), пшеничный арабинокси-лан, пектиновый галактан картофеля, галактан картофеля, рамногалактуронан (из пектиновых волокон соевых бобов), рамногалактуронан I (из пектиновых волокон картофеля), Р-глюкан ячменя произведены фирмой "Megazyme" (Ирландия). Арабиногалактан лиственницы, полигалактуро-новая кислота (ПГК, K-соль), КМЦ (Na-соль), березовый ксилан, пектин цитрусовый с степенью этерификации более 70%, п-нитрофенил-а-Ь-ара-бинофуранозид (пНФАФ) и и-нитрофенил-а-L-арабинопиранозид (пНФАП) — "Sigma" (США), пектин (из сахарной свеклы) — "Реахим" (Россия).
Коммерчески доступный сухой гранулированный свекловичный жом (СЖ) был измельчен до частиц размером 0.5—1.0 мм на мельнице MF10 basic ("IKA Werke", Германия).
Штаммы микроорганизмов. Штамм-реципиент представлял собой мутантный штамм P. canescens RN3-11-7 (niaD(-)) с дефектом в гене нитратре-дуктазы (niaD). Штамм E. coli Mach-1 (ArecA1398
endA1 tonA Ф80А1асМ15 AlacX74 hsdR(rK m K) ("In-vitrogen", США) использовали для субклонирования генов пектинлиазы (ПЕЛ), полигалактурона-зы (ПГ) и эндо-1,5-а-арабиназы (АБН), а также для препаративной наработки ДНК.
Плазмидные конструкции. Экспрессионная плазмидная конструкция pRN_Abn с целевым геном abnA была получена путем амплификации гена abnA методом ПЦР с использованием геномной ДНК штамма A. niger и олигонуклеоти-дов:
pA-UL: caaacagaagcaaccgacacaacagttgtcttcagccagatcac и pA-LL: agagcaagctgaggttaggcctggggagccgaagccaag,
и клонирования амплификата в вектор pXEGuniversal, обеспечивающий экспрессию целевого гена аЬпА за счет стабильной интегративной встройки гена в хромосому гриба Р. сапезсет. Клонирование гена аЬпА проводили с использованием метода независимого лигирования [7], неоднократно использованного ранее для получения штаммов Р. сапе-зсет [8—10]. Все стандартные процедуры с ДНК, а именно: выделение геномной ДНК, выделение ПЦР-продуктов из агарозного геля, а также выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью наборов фирмы "Qiagen" (США) по методикам фирмы-производителя. ПЦР проводили на приборе МуСус1ег ("БюКаё", США) по следующей схеме: 95°С — 4.5 мин (1 цикл), 95°С — 1 мин, 52°С - 1 мин, 68°С - 2 мин (20 циклов), 68°С -10 мин, 4°С - 50 мин.
Трансформация штамма-реципиента Р. сапе-исепи К№-11-7 (шаБ(-)), скрининг трансформантов. Трансформация штамма-реципиента Р. сапе-зсет Я№-11-7 была проведена одной или комбинацией двух или трех целевых плазмид, взятых в равных отношениях, совместно с котрансформи-рующей плазмидой pSTA10 (niaD(+)) по методике, описанной ранее [11]. Штаммы серии АБН были получены в результате трансформации штамма-реципиента Р. сапезсет Я№-11-7 одной плазмидной конструкцией pRN_Abn, серий АБН + ПЕЛ, АБН + ПГ - смесями двух плазмид: pRN_Abn и pRN_PelA, pRN_Abn и pRN_EnPG соответственно, серии АБН + ПЕЛ + ПГ - смесью трех плазмид: pRN_Abn, pRN_EnPG и pRN_Pel.
В результате трансформации были получены 110 трансформантов серии АБН, 95 и 86 трансформантов серий АБН + ПЕЛ и АБН + ПГ, и 130 трансформантов серии АБН + ПЕЛ + ПГ. Да-
лее случайным образом были выбраны по 24 трансформанта из серий АБН, АБН + ПЕЛ и АБН + ПГ и 72 трансформанта из серии АБН + ПЕЛ + ПГ и перенесены на минимальную селективную среду, а затем проанализированы методом ПЦР на наличие каждого целевого гена. На основании данных первичного скрининга методом ПЦР из каждой серии были отобраны трансформанты, содержащие целевые гены. Отобранные штаммы культивировали в колбах (емкостью 750 мл) в 100 мл ферментационной среды следующего состава (%): соевая шелуха - 4.5, кукурузный экстракт - 5.0 и КН^04 - 2.5. После культивирования в течение 144 ч на качалке при 220 об./мин и 30°С в культу-ральной жидкости (КЖ) определяли концентрацию белка и соответствующие активности АБН (по линейному арабинану), ПГ (по ПГК) и ПЕЛ (по цитрусовому пектину). Штаммы-продуценты, с различным соотношением целевых активностей, были отобраны для культивирования в ферментере и получения ФП из КЖ.
Получение ФП. Культивирование штаммов проводили в 3 л ферментерах, используя среду того же состава, что и при культивировании в колбах. ФП были получены путем лиофильного высушивания КЖ рекомбинантных штаммов-продуцентов и исходного штамма-реципиента после отделения биомассы центрифугированием при 10750 g.
Определение ферментативных активностей. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализировало образование 1 мкмоль продукта за 1 мин.
Активности по отношению к полисахаридным субстратам (5 г/л в реакционной смеси) измеряли по начальным скоростям образования восстанавливающих сахаров (ВС) при 50°С и рН 5.0 (0.1 М
Na-ацетатный буфер). ВС определяли методом Шомоди—Нельсона [12] или с использованием бицинхонинатного метода (для фракций после хроматографического разделения) [13].
Активность ПЕЛ определяли по оптической плотности при 232 нм 4,5-ненасыщенного продукта, образующегося в ходе реакции трансэлиминирования цитрусового пектина со степенью этерификацию около 70% [14].
Активность по отношению к пНФАФ и пНФАП (0.9 мМ в реакционной смеси) измеряли по скорости образования «-нитрофенола при pH 5.0 и 40°С [15].
Определение концентрации белка. Содержание белка в КЖ и ФП определяли методом Лоури [16], используя в качестве стандарта БСА, в хромато-графических фракциях — по оптической плотности при 280 нм.
Определение зависимости активности ФП от температуры и pH. Активность определяли при 50°С в диапазоне значений pH от 2.0 до 8.0, для создания которых использовали 0.1 М универсальный или лимоннокислый буфер. Активность ФП выражали в процентах от наблюдаемой при оптимальном рН. Изучение зависимости активности ФП от температуры проводили в диапазоне от 5 до 85°С в 0.1 М Na-ацетатном буфере, pH 5.0.
Стабильность ФП. Исследование термостабильности проводили при рН 5.0 при 40, 50, 60 и 85 °С. В термостатируемую ячейку помещали раствор ФП или г
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.