ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 6, с. 754-759
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 577.344.2
НОВЫЕ ФОТОИНДУЦИРОВАННЫЕ ЭФФЕКТЫ РЕАКТИВАЦИИ И ЗАЩИТЫ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ ПРИ ЛЕТАЛЬНОМ ДЕЙСТВИИ УФВ-ИЗЛУЧЕНИЯ © 2013 г. Г. Я. Фрайкин, Н. С. Беленикина, Е. В. Пиняскина, А. Б. Рубин
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 E-mail: nata.belenikina@ya.ru Поступила в редакцию 11.12.2012 г.
При кратковременном воздействии на дрожжи низкоинтенсивного монохроматического света (400—730 нм) выявлены эффекты фотореактивации и фотозащиты клеток, инактивированных средневолновым УФВ-излучением (290—320 нм). Установлено, что в инициации фотореактивации и фотозащиты наиболее активен свет красной области спектра с максимумом при 680 нм. Отмечено, что согласно изученным закономерностям они принципиально отличаются от ранее известных процессов ферментативной фотореактивации и фотозащиты, спектральная чувствительность которых ограничена соответственно синим (<450 нм) и ближним (<380 нм) УФ-светом. Получены данные, позволяющие рассматривать обнаруженные эффекты фотореактивации и фотозащиты как проявление действия одной светозависимой защитной системы, способной повышать устойчивость клеток к УФВ-излучению.
DOI: 10.7868/S0002332913060064
Из спектральных диапазонов солнечного света, достигающего поверхности Земли, наиболее сильное повреждающее действие на организмы оказывает УФ-излучение области В (290—320 нм). Фотоны УФВ-излучения, как и "неэкологического" УФС-излучения (<290 нм), в результате прямого поглощения нуклеотидными основаниями ДНК индуцируют фотохимические реакции, вызывающие летальные, мутагенные и канцерогенные эффекты. Основной вклад в развитие этих эффектов вносят циклобутановые димеры пири-мидиновых оснований (Enninga et al., 1986; Coo-hill, 1991; Mitchell et al., 1991; Jenkins, Brown, 2007). Значение УФВ-области солнечного спектра как повреждающего фактора среды обитания организмов может возрастать в связи с увеличением интенсивности УФВ-излучения в биосфере вследствие уменьшения концентрации стратосферного озона (Keftkens et al., 1990; Appenzeller, 1991; Caldwell et al, 2007).
В обеспечении устойчивости биологических систем к действию УФ-излучения существенную роль играют клеточные репарационно-защитные механизмы (Tyrrell et al., 1991; Sanear et al., 2004), среди которых особое место занимают фотоинду-цированные процессы (Фрайкин и др., 2000). Широко распространенный процесс такого рода — ферментативная фотореактивация, проявляющаяся в обратимости упомянутых выше повреждающих эффектов УФВ(С)-излучения при последующем воздействии ближнего УФ- и синего света
(350—450 нм). В основе фотореактивации лежит репарация УФ-индуцированных пиримидиновых димеров ДНК, осуществляемая светочувствительным ферментом фотолиазой с каталитически активным флавиновым хромофором (Sankar, 2008). Известен также эффект фотозащиты дрожжей от летального действия УФС(В)-излучения (Fraikin, 1992). Механизм фотозащиты связан с фотоактивацией ближним УФ-светом (320—380 нм) ферментативного синтеза серотонина, способного связываться с ДНК интеркаляционным путем и предотвращать образование пиримидиновых димеров (Фрайкин и др., 1985; Fraikin et al, 1989). Из сравнения процессов фотозащиты и ферментативной фотореактивации следует, что их спектральная чувствительность ограничена соответственно ближним УФ- и коротковолновым видимым светом.
Цель работы — исследование фотозащитной активности длинноволнового видимого света при летальном действии УФВ-излучения на клетки дрожжей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Дрожжи Candida guilliermondii и Saccharomyces cerevisiae выращивали по стандартной схеме (Fraikin et al., 1996). Перед облучением клетки дважды центрифугировали при 5000 об./мин 5 мин и отмывали дистиллированной водой, после чего их разводили в солевой среде (Страхов-
ская и др., 1993) до концентрации 105 кл./мл. Облучение проводили при 22°С и постоянном перемешивании суспензии. После облучения клетки высевали на агаризованные пластинки и инкубировали в течение 24 ч при 32°С. О выживаемости дрожжей судили по результатам подсчета колоний под микроскопом (метод микроколоний). Каждый эксперимент по облучению и определению выживаемости клеток проводился в трех по-вторностях. Источником света служила ртутная лампа высокого давления (ДРШ-1000, Россия). УФВ-область спектра (290—320 нм) выделяли комбинацией светофильтров УФС-2 и ЖС-3 (Россия). Интенсивность УФВ-излучения на уровне образца составляла 5 Вт/м2. Для получения монохроматического света в области 330—730 нм использовали дифракционный спектрограф с линейной дисперсией 1 нм/мм. Рассеянное излучение более коротких длин волн отсекали фильтром БС-5 (Россия). Интенсивность монохроматического света при каждой длине волны (334, 365, 405, 436, 498, 546, 578, 610, 630, 660, 680, 710 и 730 нм) была выравнена и на уровне образца составляла ~0.2 Вт/м2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
У дрожжей С. guilliermondii в отличие от других видов дрожжей, включая Б. cerevisiae (8агаеИек, ВьзИ, 1975), отсутствует механизм ферментативной фотореактивации, т.е. выживаемость УФ-инакти-вированных клеток С. guilliermondii не может быть повышена при последующем их облучении светом в области 350—400 нм (Рга1кт et al, 1980). С использованием низкоинтенсивного монохроматического света длинноволнового участка видимого спектра (600—730 нм) мы выявили у дрожжей С. guilliermondii эффекты фотовосстановления жизнеспособности клеток, инактивированных УФВ-излучением. Такие же эффекты фотовосстановления были обнаружены нами и у способных к ферментативной фотореактивации дрожжей Б. сerevi-siae. В качестве примера на рис. 1 приведены типичные кривые фотовосстановления клеток (С. guilliermondii и Б. сerevisiae), полученные при действии монохроматического света 680 нм (при этой длине волны наблюдались максимальные эффекты). Видно, что у обоих видов дрожжей кривая фотовосстановления характеризуется наличием максимума, который достигается кратковременным (несколько минут) воздействием монохроматического света в малых дозах, и снижением эффективности при увеличении времени (дозы) облучения.
Низкоинтенсивный монохроматический видимый свет более коротковолнового диапазона (400—580 нм) также вызывал фотовосстановление УФВ-инактивированных клеток С. guilliermondii и Б. сerevisiae, причем зависимости эффектов от
Время облучения, мин
Рис. 1. Динамика изменения выживаемости УФВ-инактивированных клеток C. guilliermondii (1) и S. ce-revisiae (2) в зависимости от времени (дозы) облучения монохроматическим светом (680 нм). Дозы УФВ-облу-чения (30% выживаемости) 2.4 (1) и 2.1 кДж/м2(2). Каждая точка отражает среднее значение из семи экспериментов, для рис. 1 и 2.
времени (дозы) облучения имели характер, сходный с таковым для кривых, представленных на рис. 1 (данные не приведены). Низкоинтенсивный монохроматический ближний УФ-свет (365 нм) не влиял на выживаемость УФВ-облученных клеток, хотя в спектре действия ферментативной фотореактивации у дрожжей S. cerevisiae при 365—385 нм находится максимум (Sanear, 1990).
Исходя из эффективности фотовосстановления УФВ-инактивированных клеток, которую определяли на начальных (линейных) участках дозовых кривых (рис. 1) при каждой длине волны в области 400—730 нм, был построен спектр действия фотореактивации (рис. 2). Эффективность фотореактивации при каждой длине волны определяли как величину, обратную дозе монохроматического света, при которой выживаемость УФВ-инактивирован-ных клеток возрастала до 50%. За относительную активность принимали эффективность фотореактивации при данной длине волны по отношению к эффективности при 405 нм, которая принята за единицу. Полученный спектр действия отражает, вероятно, участие одного фоторецептора в инициации процессов, приводящих к фотореактивации УФВ-инактивированных клеток. В пользу этого
Рис. 2. Спектр действия фотореактивации клеток С. guiШermondii, инактивированных УФВ-излучением.
свидетельствует сходная форма кривых фотовосстановления при всех использованных длинах волн видимого света.
Установленная форма кривых фотореактивации (рис. 1) принципиально отличается от известных дозовых кривых ферментативной фотореактивации, достигающих уровня насыщения при больших дозах ближнего УФ- и синего света (8агасИек, ВьзИ, 1975). Указанные различия позволили разделить два типа фотопроцессов путем изменения режимов облучения клеток синим светом, проявляющим активность (у дрожжей 8. сerevisiae) как в ферментативной фотореактивации, так и в фотореактивации с максимумом при 680 нм. На рис. 3 приведены результаты опытов, в которых клетки последовательно подвергали воздействию УФВ-излучения и монохроматического света (405 нм) разной интенсивности: 0.2 и 1.5 Вт/м2 в первые 30 мин и при дальнейшем освещении той же суспензии соответственно. Отчетливо видно наличие двух форм кривых фотореактивации: кривой с выраженным максимумом при кратковременном действии света, характерной для обнаруженного эффекта, и кривой достигающей насыщения при больших дозах света, типичной для ферментативной фотореактивации.
Время облучения, мин 0 10 20 30 60 90 120
Доза облучения, Дж/м2
Рис. 3. Зависимости выживаемости УФВ-инактивированных клеток 8. сerevisiae от дозы (времени) облучения монохроматическим светом (405 нм) при 22°С (1) и 4°С (2). Стрелка — изменение интенсивности монохроматического света от 0.2 до 1.5 Вт/м2. Доза УФВ-облучения (30% выживаемости) 2.1 кДж/м2. Каждая точка отражает среднее значение из пяти экспериментов, для рис. 3 и 5.
Из рис. 3 также следует, что понижение температуры до 4°С в период освещения не влияет на эффективность описываемой фотореактивации (ферментативная фотореактивация, как известно, при низких температурах ингибируется). Этот факт свидетельствует, очевидно, о фотохимической природе процессов, протекающих с участием фоторецептора на начальной (световой) стадии фотореактивации.
Можно предположить, что форма кривой зависимости фотореактивации от времени освещения (рис. 1 и 3) определяется особенностями светои
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.