БИОХИМИЯ, 2012, том 77, вып. 9, с. 1186 - 1200
УДК 577.24
НОВЫЕ МИТОХОНДРИАЛЬНО-НАПРАВЛЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, ПОСТРОЕННЫЕ ИЗ ПРИРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ: КОНЪЮГАТЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ АЛКАЛОИДОВ БЕРБЕРИНА И ПАЛЬМАТИНА C ПЛАСТОХИНОНОМ
Обзор
© 2012 г. Б.В. Черняк1*, Ю.Н. Антоненко1, Е.Р. Галимов1, Л.В. Домнина1, В.Б.Дугина1, Р.А. Звягильская2, О.Ю. Иванова1, 1, К.Г. Лямзаев1, А.В. Пустовидко1, Т.И. Рокицкая1, , И.И. Северина1, Р.А. Симонян1, М.В. Скулачев1, В.Н. Ташлицкий1, Е.В. Титова1, Т.А. Тренделева2, Г.С. Шагиева1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и Центр митоинженерии, 119991 Москва; факс: (495)939-3181, электронная почта: fxb@belozersky.msu.ru 2 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп. 33; факс: (495)954-2732, электронная почта: inbi@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 20.04.12
Разработаны новые митохондриально-направленные соединения, состоящие исключительно из природных компонентов. Они представляют собой конъюгаты веществ растительного происхождения — проникающих катионов берберина или пальматина с антиоксидантом пластохиноном (8крВегЪ, 8крРа1ш), — а также их аналоги, лишенные остатка пластохинона (С10ВегЪ и С10Ра1ш). Их активность протестирована с использованием искусственных фосфолипидных мембран, изолированных митохондрий и культивируемых клеток человека. Показано, что все новые соединения проникают через фосфолипидный бислой в катионной форме и накапливаются как в изолированных митохондриях, так и в митохондриях живой клетки. Восстановленные формы 8крВегЪ и 8крРа1ш в наномолярных концентрациях ингибируют перекисное окисление ли-пидов в митохондриях. Ни в изолированных митохондриях, ни в клетках не происходит восстановления остатков берберина и пальматина, так что антиоксидантная активность целиком определяется остатком пластохинона. В фибробластах человека 8крВегЪ и 8крРа1ш в наномолярных концентрациях предотвращают фрагментацию митохондрий и апоптоз, вызванные перекисью водорода. При более высоких концентрациях они индуцируют транспорт протонов через искусственные и митохондриальные мембраны. Этот процесс зависит от присутствия свободных жирных кислот и ускоряется (в мембране митохондрий) при участии транслокатора адениновых нуклеотидов. Обсуждается возможность использования новых митохондриаль-но-направленных антиоксидантов для изучения сигнальных механизмов в клетке. Показано, что 8крВегЪ и 8крРа1ш вызывают торможение клеточного цикла, индукцию дифференцировки и морфологическую нормализацию различных типов опухолевых клеток. Предполагается, что продукция кислородных радикалов в митохондриях необходима для передачи сигнала от ростовых факторов через каскад МАР-киназ на пролиферацию и поддержание фенотипа некоторых трансформированных клеток.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондриально-направленные антиоксиданты, 8кр, берберин, пальматин, фос-фолипидные мембраны, митохондрии, опухолевые клетки.
Д.С. Изюмов А.Г. Рогов2
Принятые сокращения: АНТ — транслокатор адениновых нуклеотидов; АФК —активные формы кислорода; АМУЫ — 2,2'-азо-ди(2,4'-диметилвалеронитрил); БЛМ — бислойная фосфолипидная мембрана; СМ-ОСБ-ВА — 5-(-6)хлорметил-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат; С12ТРР — додецилтрифенилфосфоний; С10ВегЪ — 13-(децилоксикарбонилме-тил)берберин; С10Ра1ш — 13-(децилоксикарбонилметил)пальматин; 8кр1 — 10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфос-фоний; 8крВегЪ — 13-[9-(6'-пластохинонил)нонилоксикарбонилметил]берберин; 8крРа1ш — 13-[9-(6'- пластохино-нил)нонилоксикарбонилметил]пальматин; — 10-(6'-пластохинонил)децилродамин-19; ТРР+ — тетрафенилфосфо-
ний; БССР — трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон; ЖК — жирная кислота; А^ — трансмембранная разность электрических потенциалов. * Адресат для корреспонденции.
Идея Питера Митчелла [1] о ключевой роли трансмембранной разности потенциалов (Ду) в сопряжении окисления субстратов и синтеза АТР перевернула представления, сложившиеся в этой области в 60-х гг. ХХ в. Идея Е.А. Либер-мана и В.П. Скулачева [2] об использовании ионов, проникающих через липидный бислой, для измерения Ду в митохондриях привела к экспериментальному доказательству гипотезы Митчелла. В XXI в. развитие этой идеи дало толчок к созданию нового класса соединений, эффективно и избирательно накапливающихся в митохондриях живой клетки [3]. Успехи в этой области позволяют надеяться, что митохондри-ально-направленные лекарственные средства окажутся эффективными при лечении многих тяжелых недугов человека, включая старческие болезни и сам процесс старения [4].
Наиболее известным представителем семейства проникающих ионов был и остается катион тетрафенилфосфония (ТРР+). Его основные достоинства — высокая проникающая способность при хорошей растворимости в воде и низкие реакционная и сорбционная активности по отношению к компонентам клетки. ТРР+ и его конъюгаты широко используются для измерения мембранного потенциала и для доставки в митохондрии различных соединений. Среди «грузов», доставляемых в митохондрии, наиболее популярны различные антиоксиданты и индикаторы активных форм кислорода (АФК). Такая направленность базируется на представлениях о том, что митохондрии являются основным источником АФК в клетке, а избыточная продукция АФК определяет развитие различных патологий и старения. Семейство митохондри-ально-направленных антиоксидантов представлено конъюгатами ТРР+ с убихиноном (MitoQ) [5], пластохиноном (SkQ) [6], токоферолом (MitoVitE) [7], липоевой кислотой (MitoL) [8], эбселеном (MitoPeroxidase) [9] и со спиновыми ловушками (MitoPBN, MitoCP, Mito-TEMPO) [10—12]. К митохондриально-направленным индикаторам АФК относятся конъюгаты ТРР+ с дигидроэтидином (MitoSOX) [13] и производными бороната (MitoPY) [14].
Второе место по популярности среди проникающих катионов занимают флуоресцентные производные родаминов, введенные в биоэнергетическую практику одновременно Лан Бо Че-ном [15] и В.П. Скулачевым [16]. Различные ро-дамины и их эфиры широко используются для визуализации митохондрий и измерения мембранного потенциала митохондрий в клетках. Конъюгат родамина-19 с децилпластохиноном (SkQR1) — один из наиболее эффективных антиоксидантов в моделях in vivo [17]. Для измере-
ния митохондриальных АФК используется ди-гидрородамин, который приобретает флуоресценцию после окисления. Следует отметить, что положительный заряд дигидрородамина также возникает лишь после его окисления, что затрудняет интерпретацию получаемых данных [18]. В 2005 г. в качестве митохондриально-на-правленных катионов были предложены соединения, содержащие две и более гуанидиновые группы [19]. Механизм накопления этих веществ в митохондриях изучен недостаточно. Не исключено участие белков-переносчиков в их транспорте, поскольку проницаемость многозарядных ионов через липидный бислой чрезвычайно мала [20].
В заключение исторического обзора надо отметить, что к семейству проникающих катионов относятся фусцин, янус зеленый, кристаллвио-лет и другие гистологические красители, применявшиеся для окраски митохондрий начиная с середины XIX в. Их прямыми потомками являются различные митотрекеры (Мко^аскеге™), широко используемые (в том числе и для тех же целей) в настоящее время.
При исследовании конъюгатов ТРР+ и рода-минов была обнаружена их способность катализировать перенос протонов через липидный бислой [21]. В случае производных ТРР+ этот эффект связан с ускорением крайне медленного транспорта анионов жирных кислот (ЖК), который определяет низкую протонофорную активность ЖК в фосфолипидных мембранах. Аналогичное действие ТРР+ (которое проявлялось в значительно более высоких концентрациях) было описано почти 20 лет назад [22]. В случае производных родамина-19 протонофорная активность не зависит от ЖК и определяется протонированием—депротонированием остатка родамина [23]. Использование катионов в качестве митохондриально-направленных разобщителей окислительного фосфорилирования представляет исключительно большой интерес как возможный способ борьбы с ожирением. Главным преимуществом митохондриально-направ-ленных катионов перед традиционными прото-нофорами-разобщителями является зависимость их активности от потенциала. Можно полагать, что снижение потенциала под действием катионов будет ограничено, поскольку при этом снижается и движущая сила, необходимая для их транспорта.
Ни производные ТРР+, ни родамины не являются природными соединениями. Это обстоятельство сыграло важную роль в их применении для измерения потенциала, так как исключало участие специфических механизмов транспорта этих веществ через мембрану митохонд-
рий. В настоящее время, когда актуален вопрос о долгосрочном применении лекарств, созданных на их основе, искусственная природа этих катионов вызывает законные опасения. В поисках природных проникающих катионов мы обратили внимание на изохинолиновые алкалоиды берберин и пальматин, характерные для растений семейства Berberidaceae. Экстракты, содержащие берберин и пальматин, используются в традиционной китайской медицине на протяжении многих веков. Фармакологические исследования выявили многочисленные положительные эффекты применения этих алкалоидов при диабете, воспалительных процессах, аритмии, гипертонии и т.д. Описано противоопухолевое действие берберина, которое связывают с цитостатическим эффектом и с подавлением ангиогенеза в опухолях [24]. Механизмы терапевтического действия алкалоидов остаются неизвестными, однако исследования in vivo показали выраженное антиоксидантное действие берберина [25] или продуктов его превращения [26]. В модельных бесклеточных системах бер-берин способен ингибировать перекисное окисление липидов, но лишь в восстановленной форме [27]. Показано, что берберин может накапливаться в митохондриях живых клеток, а согласно опытам на бислойных фосфолипидных мембранах (БЛМ) берберин и пальматин проникают через бислой в катионной форме [28].
В 2010 г. [29] нами были синтезированы конъюгаты берберина и пальматина с децил-пластохиноном (SkQBerb и SkQPalm), а также их аналоги, лишенные хинонового остатка, C10Berb и C1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.