ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 9, с. 1263-1268
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.17:616-056.7:616-006.6
НОВЫЕ МУТАЦИИ В ГЕНЕ BRCA1 У ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ИЗ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА
© 2007 г. О. С. Тихомирова, Н. А. Грудинина, В. И. Голубков, М. Ю. Мандельштам, В. Б. Васильев
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург 197376; факс: (812) 234-94-89; e-mail: michail@MM13666.spb.edu
Поступила в редакцию 04.11.2006 г.
При исследовании гена BRCA1 у больных с семейными формами рака молочной железы Санкт-Петербурга идентифицировано три мутации (4146del3, 2761delA, A622V) и два полиморфизма (P871L, S1436S). Мутации 4146del3, 2761delA являются новыми, не описанными в других странах мира. Де-леция 2761delA приводит к сдвигу рамки считывания, преждевременной терминации синтеза белка и может вызывать предрасположенность к развитию рака молочной железы. Делеция 4146del3 не нарушает рамки считывания, но она может приводить не только к исчезновению аминокислотного остатка (D1343del) в структуре белка BRCA1, но также вызывать нарушение пространственной укладки белка и, как следствие, потерю им функциональной активности. Два варианта нуклеотид-ной последовательности, найденные у целого ряда пациентов, классифицированы нами как ДНК-полиморфизмы (P871L, S1436S), а не как мутации, поскольку они жестко не ассоциированы с повышенным риском развития рака молочной железы.
Рак молочной железы относится к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям среди женщин. Около 10% случаев данного заболевания связаны с наследственной предрасположенностью, обусловленной мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Вероятность развития рака молочной железы у носителей мутации в любом из этих генов достигает 80% [1]. В мире интенсивно изучается спектр мутаций в генах семейства BRCA, различный в разных популяциях. Знание спектров мутаций, характерных для страны или региона, позволяет с помощью ДНК-диагностики выявлять группы риска развития заболевания. В России исследования генов семейства BRCA начаты сравнительно недавно, однако они уже показали наличие одной мажорной мутации 5382^С в популяции и существенные различия спектра мутаций в гене BRCA1 в различных регионах страны [2-8]. Предыдущие исследования популяции Санкт-Петербурга выявили 10 различных вариантов в гене BRCA1 (семь мутаций и три полиморфизма) [8]. В данной работе описаны еще три мутации и два полиморфных варианта, найденные у больных с семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Отбор пациентов с первичным раком молочной железы и яичника проводился сотрудниками НИИ онкологии им. H.H. Петрова. Критерии от-
бора пациентов для включения в исследование были описаны ранее [8].
Биохимические методы. Выделение ДНК из крови проводили по методу Кюнкеля [9] в модификации Белла [10]. Для амплификации экзонов гена BRCA1 использовали олигонуклеотидные праймеры, синтезированные фирмами "Литех" и "Синтол" (Москва) по опубликованным последовательностям [11]. Экзон 11 гена BRCA1 слишком велик для исследования в качестве одного ампли-кона, поэтому он был разбит на перекрывающиеся фрагменты, обозначаемые номером экзона с последовательными латинскими буквами [11]. Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью программируемого термостата ТЕРЦИК (Москва), используя реактивы фирмы "Медиген" (Новосибирск). Продукты амплификации проверяли в 8%-ном полиакриламидном геле в однократном трис-боратном буфере (ТВЕ) с последующим окрашиванием ДНК нитратом серебра. Поиск мутаций осуществляли методом анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ), проводившегося в условиях, при которых выявляются и гетеро-дуплексы.
Для клонирования продуктов амплификации использовали линеаризованную плазмиду фирмы "Медиген" (Новосибирск) и лигазу фирмы "Amer-sham Biosciences" (Англия). Трансформацию E. coli штамма DH5a плазмидами со вставкой фрагмента гена BRCA1 проводили стандартным кальций-
A TTTCA GATG A A Б T T T C A GAT GATG A A
Рис. 1. Результаты автоматического секвенирования клонированного фрагмента гена BRCA1 с мутацией 4146-4148delGAT (4146del3, D1343del). А - измененная последовательность гена BRCA1, Б - каноническая последовательность гена BRCA1.
A A A Б A A
G G A T G T G G G A A T G T G
Рис. 2. Результаты автоматического секвенирования клонированного фрагмента гена BRCA1 с мутацией 276Ме1А. А - измененная последовательность гена BRCA1, Б - каноническая последовательность гена BRCA1.
хлоридным методом. Отбор рекомбинантов осуществляли на среде с антибиотиком и хромогеном X-Gal [12]. Плазмиду для секвенирования выделяли методом щелочного лизиса [12]. Определение последовательности ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ALF Express-2 ("Amer-sham Biosciences") с использованием меченных флуорофором Cy-5 дидезоксинуклеозидтрифос-фатов или праймеров.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В исследовании использовали образцы ДНК 43 онкологических пациентов с семейной историей заболевания. Мы осуществили скрининг восьми фрагментов 11-го экзона гена BRCA1 (11F, 11D, 11D2, 11E, 11E2, 11I, 11I2, 11P), а также экзонов 13 и 19. Исследование других фрагментов экзона 11 было осуществлено нами ранее [8]. В исследовании использовали два варианта SSCP-анализа: разделение в трис-глициновой системе с визуализацией ДНК при окрашивании ее нитратом серебра и автоматический флуоресцентный SSCP-ана-лиз, проводимый на приборе ALF Express-2. Для флуоресцентного SSCP-анализа применяли меченные флуорофором Cy-5 праймеры. Образцы с дополнительными зонами однонитевых конфор-меров секвенировали напрямую. Образцы, в которых были обнаружены гетеродуплексы, клонировали для разделения мутантного и нормального аллелей.
При исследовании фрагмента 11P мы обнаружили наличие дополнительных зон - гетеродуп-
лексов, которые при электрофорезе в денатурирующих условиях давали две отдельные зоны. По расположению этих зон предположили, что данный образец имеет делецию. Продукт амплификации клонировали и секвенировали. Анализ последовательности показал делецию трех нуклеотидов, которую мы согласно правилам номенклатуры назвали 4146ёе13 (рис. 1).
Анализ фрагмента 1112 у одного из пациентов показал аномальную картину распределения зон однонитевых конформеров. После клонирования и секвенирования была обнаружена делеция одного нуклеотида, названная 2761ёе1А (рис. 2). В этом же экзоне был идентифицирован широко распространенный вариант нуклеотидной последовательности гена BRCA1, известный как полиморфизм Р87^.
В экзоне 11Е2 с помощью автоматического флуоресцентного SSCP-анализа с последующим прямым секвенированием гетерозиготы была обнаружена миссенс-мутация А622У (рис. 3). В результате данной мутации исчезает сайт для ре-стриктазы Ика\. Результаты рестрикционного анализа, использованного для верификации варианта, представлены на рис. 4.
При изучении экзона 13 был идентифицирован лишь известный полиморфизм S1436S, мутаций в этом экзоне найдено не было. Полный список обнаруженных нами мутаций и полиморфизмов приведен в табл. 1.
26 27 А 28 29
410
268
26
27
28
29
Рис. 3. Идентификация мутации А622У в экзоне 11Е2 гена BRCA1 с помощью автоматизированного флуоресцентного SSCP-анализа. Дорожки: 26, 27,29 - разделение однонитевых конформеров образцов без мутации (норма); 28 - разделение однонитевых конформеров образца с мутацией в гетерозиготном состоянии. Стрелкой указано появление дополнительного пика (полосы) на дорожке 28, что свидетельствует о наличии мутации в одном из аллелей этого образца. А - разделение однонитевых конформеров в геле (компьютерное представление), Б - компьютерная обработка данных на приборе "ALFExpress".
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время в мире известно 1200 мутаций и полиморфизмов в гене BRCA1, причем для каждой популяции характерен свой набор генетических изменений [13]. Знание региональных спектров мутаций позволит разработать быстрые методы тестирования широко распространенных патогенных вариантов и значительно ускорить
142
400 -300
200
100
Рис. 4. Результаты рестрикционного анализа фрагмента 11Е2 гена BRCAl с помощью эндонуклеазы HhaI. 1 - продукты гидролиза амплифицированной ДНК гетерозиготного по мутации А622У пациента; 2 -продукты гидролиза образца ДНК без мутации; 3 -образец ДНК, не подвергнутый гидролизу; 4 - маркер молекулярного веса с шагом 100 пн. Стрелками указаны размеры фрагментов в пн. Видно, что в образце с мутацией (дорожка 1) из-за исчезновения сайта узнавания для рестриктазы HhaI сохраняется фрагмент, соответствующий полноразмерному продукту амплификации экзона 11Е2 (410 пн).
процесс обнаружения генетических дефектов у людей, составляющих группу риска. В нашем исследовании у 43 больных с семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге были обнаружены три различных мутации и два полиморфизма в 11-м и 13-м экзонах гена BRCA1 (табл. 1).
Мутация 276Ые1А была обнаружена у одного из пробандов, рак молочной железы у которой был диагностирован в 40 лет. Данная делеция приводит к сдвигу рамки считывания и образованию стоп-кодона в позиции 892. В результате это-
Таблица 1. Мутации и полиморфизмы в гене BRCA1, найденные у больных раком молочной железы Санкт-Петербурга
Мутация Изменение в ДНК Экзон Быстрый метод тестирования Число семей(пациентов) с мутацией
276Ые1А D1343de1 А622У с.276Ые1А c.4146de13 (4146-4148 de1GAT) С.1984С/Т 1112 11Р 11Е2 88СР-анализ Гетеродуплексы 88СР-анализ 1(1) 1(1) 1(1)
Полиморфизм Изменение в ДНК Экзон Быстрый метод тестирования Частота встречаемости аллелей (п = 38)
Р87^ 814368 CCG>CTG; с.2731 С>Т ТСТ>ТСС; с.4427 Т>С 1112 13 88СР-анализ 88СР-анализ 0.63/0.37 0.63/0.37
Таблица 2. Доля семей с повторяющимися и уникальными мутациями в гене BRCA1 в семьях высокого риска рака молочной железы и яичника из разных популяций
Популяция Доля семей с мутацией 5382insC Доля семей с повторяющимися мутациями Доля семей с широко распространенными мутациями Доля семей с уникальными для популяции мутациями Суммарная доля семей с идентифицированными мутациями в гене BRCA1
Сан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.