МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 5, с. 858-868
= ДНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДК 547.963.32.057:542.95
НОВЫЕ НЕГИДРОЛИЗУЕМЫЕ АНАЛОГИ СУБСТРАТОВ 8-ОКСОГУАНИН-ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗ
© 2004 г. М. В. Тараненко, Е. М. Волков, М. К. Сапарбаев1, С. А. Кузнецова*
Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992
1 CNRS-UMR 8532, Institut Gustave Roussy, 94805 Villejuif, France Поступила в редакцию 11.03.2004 г.
8-Оксогуанин-ДНК-гликозилазы играют ключевую роль в репарации окислительных повреждений ДНК. Ферменты эксцизионной репарации формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза Escherichia coli (Fpg) и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека (hOGGl) катализируют удаление остатков 7,8-ди-гидро-8-оксогуанина (oxoG) из ДНК и последующее расщепление углеводофосфатного остова. Контакты между фосфатными группами ДНК и аминокислотами из активных центров этих ферментов играют важную роль в специфическом связывании и катализе. С целью создания негидро-лизуемых аналогов субстратов Fpg и hOGGl изучено влияние модификации фосфатных групп, связанных с поврежденным нуклеозидом, на субстратную специфичность модифицированных ДНК-дуплексов. Новые oxoG-шдержащие аналоги субстратов Fpg и hOGGl сконструированы на основе синтетических ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатную либо замещенную пирофосфатную группу, связанную с 5'(3')-ОН-группами 8-оксогуанозина. Показано, что эти соединения узнаются и специфически связываются исследуемыми ферментами. При изучении механизма их взаимодействия с Fpg и hOGGl установлено, что модификация межнуклеотидного фосфата, связанного с 3'-ОН группой 8-оксогуанозина, препятствует выщеплению остатка oxoG из поврежденной цепи ДНК. Вместе с тем показано, что оба фермента эффективно расщепляют ДНК-дуплексы с аналогичной модификацией фосфата, связанного с 5'-ОН-группой oxoG. ДНК-дуплексы, содержащие пирофос-фатную/замещенную пирофосфатную группу на 3'-ОН 8-оксогуанозина, являются негидролизуе-мыми аналогами субстратов исследуемых 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз и могут быть использованы для проведения структурных исследований комплексов oxoG-шдержащих ДНК с каталитически активными формами этих ферментов и их про- и эукариотических гомологов.
Ключевые слова: репарация ДНК, формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза Escherichia coli, 8-оксо-гуанин-ДНК-гликозилаза человека, модифицированные ДНК-дуплексы, 7,8-дигидро-8-оксогуанин, пирофосфатная и замещенная пирофосфатная межнуклеотидные группы, белково-нуклеиновые взаимодействия.
NEW NON-HYDROLYZABLE SUBSTRATE ANALOGS FOR 8-OXOGUANINE-DNA GLYCOSYLAS-ES, by M. V. Taranenko, E. M. Volkov, M. K. Saparbaevl, S. A. Kuznetsova* (Chemistry Department, Moscow State University, Moscow 119992, Russia; E-mail: svetlana@belozersky.msu.ru; 1CNRS-UMR 8532, Institut Gustave Roussy, 94805 Villejuif Cedex, France). 8-Oxoguanine-DNA glycosylases play a key role in the repair of oxidatively damaged DNA. The Escherichia coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase (Fpg) and human 8-oxoguanine-DNA glycosylase (hOGGl) are DNA base excision repair enzymes that catalyze the removal of 7,8-dihydro-8-oxoguanine (oxoG) residue, and cleave DNA strand. Specific contacts between DNA phosphate groups and amino acids from active centers of these enzymes play a significant role in DNA-protein interactions. In order to design new non-hydrolyzable substrate analogs of Fpg and hOGGl for structural studies modified DNA duplexes containing pyrophosphate or OEt-substituted pyrophosphate internucleotide (SPI) groups near the damage were tested. We showed that enzymes recognize and specifically bind to DNA duplexes obtained. The mechanism of incision of oxoG by the Fpg and hOGGl was determined. We revealed that both enzymes were not able to excise the oxoG residue from DNA containing modified phosphates immediately 3' to the oxoG. In contrast, Fpg and hOGG1 effectively incise DNA duplex carrying analogous phosphate modifications 5' to the oxoG. Non-cleavable oxoG-containing DNA duplexes bearing pyrophosphate or substituted pyrophosphate groups immediately 3' to the oxoG are specific inhibitors for both 8-oxoguanine-DNA glycosy-lases and can be used for structural studies of complexes comprising a oxoG-containing DNA bound to cata-lytically active wild-type enzymes as well as their pro- and eucaryotic homologs.
Принятые сокращения: Fpg - формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза Escherichia coli, hOGGl - 8-оксогуанин-ДНК-глико-зилаза человека, UDG - урацил-ДНК-гликозилаза, oxoG - 7,8-дигидро-8-оксогуанин, AP-участок - апуриновый/апиримиди-новый участок в ДНК.
* Эл. почта: svetlana@belozersky.msu.ru
Репарация ДНК - важнейший биологический процесс, обеспечивающий стабильность и целостность генетической информации. Нарушения в системе репарации могут быть причинами преждевременного старения, аутоиммунных, кардиологических, онкологических и ряда других заболеваний [1-4]. Одним из наиболее агрессивных факторов окружающей среды, индуцирующих повреждения во всех основных клеточных компонентах, является активная форма кислорода. В ДНК свободные радикалы кислорода могут повреждать как гетероциклические основания, так и углеводофосфатный остов [5-8]. Основным результатом их воздействия является образование oxoG, обладающего мутагенным потенциалом, поскольку генерация oxoG в клеточной ДНК приводит к G : C —► Т : А трансверсии in vivo и in vitro [9, 10]. oxoG репарируется во всех организмах от бактерий до млекопитающих. Ключевую роль в этом процессе играют ферменты эксцизионной репарации - 8-оксогуанин-ДнК-гликозилазы [11]. Их физиологическая роль в клетке заключается в предотвращении мутагенного потенциала oxoG и сохранении генетической стабильности.
Ферменты эксцизионной репарации формами-допиримидин-ДНК-гликозилаза E. coli (Fpg) и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека (hOGG1) катализируют удаление остатков oxoG из ДНК и последующее расщепление углеводофосфатного остова. Fpg и hOGG1 являются бифункциональными ДНК-гликозилазами/АР-лиазами, катализирующими выщепление остатков oxoG из комплементарной пары oxoG : С. Оба фермента имеют одинаковую субстратную специфичность, но у них различные механизм действия и структурная организация [12]. Фермент Fpg, известный также как MutM [13], помимо N-гликозилазной обладает еще тремя активностями и катализирует полное выщепление поврежденного нуклеозида из ДНК с помощью каскада многоступенчатых реакций [14]. Проявляя АР-лиазную активность, фермент выщепляет из ДНК АР-участки, образовавшиеся при расщеплении N-гликозидной связи, по механизму ß,5-элиминирования с образованием промежуточного интермедиата - основания Шиффа. В результате в ДНК образуется одноце-почечный разрыв, фланкированный 3'- и 5'-кон-цевыми фосфатами [15]. Кроме того, Fpg проявляет дезоксирибозофосфатазную активность, выщепляя из ДНК 5'-концевой дезоксирибозофо-сфат, образующийся при расщеплении ДНК АР-эндонуклеазами по АР-участкам [16]. В отличие от Fpg, фермент hOGG1 кроме N-гликозилазной проявляет только ß-лиазную активность, расщепляя ДНК с З'-конца от повреждения [17].
По данным рентгеноструктурного анализа Fpg и hOGG1 установлено, что эти ферменты имеют
различную пространственную организацию и принадлежат к разным суперсемействам ДНК-гликозилаз [12]. В результате структурных исследований комплексов прокариотических гомологов Fpg - формамидопиримидин-ДНК-гликози-лаз Lactobacillus lactis [18] и Bacillus stearothermo-philus [19] - с аналогами ДНК, содержащими АР-участки, а также исследования структуры кова-лентного комплекса Fpg-ДНК, образующегося при восстановлении основания Шиффа борогид-ридом натрия [12], получена ценная информация об общей архитектуре белково-нуклеинового комплекса и особенностях специфического узнавания/связывания этими ферментами АР-участков в ДНК. В результате анализа кристаллических структур комплексов мутантных каталитически неактивных форм Fpg [20] и каталитического кора hOGG1 [21], содержащих замены функционально значимых аминокислот, с oxoG-содержа-щей ДНК выявлены особенности взаимодействия повреждения с мутантными белками. Однако знание структурных аспектов специфического узнавания и выщепления остатка oxoG каталитически активными формами Fpg и hOGG1 дикого типа, а также узнавания и выщепления этими ферментами достаточно широкого спектра структурно различающихся семейств окислительных повреждений, ограничено тем обстоятельством, что до настоящего времени не удается получить кристаллы комплексов каталитически активных форм ферментов с oxoG-содержащими ДНК. Известно, что получение кристаллов комплексов ДНК-гликозилаз с содержащими повреждение ДНК осложнено тем, что "wild-type" ферменты расщепляют свои субстраты намного быстрее, чем протекает сам процесс кристаллизации и сбор данных. В связи с этим, одной из задач в данной области исследований является дизайн и синтез oxoG-содержащих негидролизуемых аналогов субстратов 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз, способных формировать стабильные специфические комплексы с ферментами.
Цель настоящей работы - дизайн и синтез негидролизуемых oxoG-содержащих аналогов субстратов 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg и hOGG1 для проведения структурных исследований комплексов каталитически активных форм этих ферментов с oxoG-содержащими ДНК. К настоящему времени такие соединения в литературе не описаны. В работе исследованы субстратные свойства синтетических ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы, связанные как с 5', так и с З'-ОН-группами 8-оксогуанози-на. Изучен механизм их взаимодействия с Fpg и hOGG1. На основе этих соединений предложены новые oxoG-содержащие негидролизуемые аналоги субстратов 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Олигодезоксирибонуклеотиды природного строения, использованные в работе, синтезированы амидофосфитным методом на автоматическом ДНК-синтезаторе "Applied Biosystems 380B" (США) по стандартному регламенту. Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов с включением остатков 7,8-дигидро-8-оксогуани-на осуществляли с использованием коммерческого З'-амидофосфитного
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.