ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.61:616-093
НОВЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ, ИХ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА И ОЦЕНКА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА © 2015 г. Н. В. Харченко1, Т. А. Чердынцева, А. И. Нетрусов
Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Поступила в редакцию 26.06.2014 г.
Из экскрементов новорожденных детей и животных получено более 90 накопительных культур и выделены 6 устойчиво растущих штаммов бифидобактерий, обладающих пробиотическими свойствами. Один из этих штаммов согласно результатам проведенной молекулярной диагностики был отнесен к виду Bifidobacterium bifidum и 5 — к B. animalis. Для первичной идентификации штаммов были применены пары праймеров на ген 16S рибосомальной РНК (рРНК) — g-Bifid-F/R, Bif164/662 и пара праймеров на ген xfp r/f, специфичные для бифидобактерий. Последующее секвенирование полноразмерных генов, кодирующих синтез 16S рРНК выделенных штаммов, подтвердило их видовую принадлежность. Выделенные культуры обладают высокой устойчивостью RD (Resistance Degree) 5 < RD < 10 к гастроэнтерологическом стрессу, что позволяет рекомендовать их в качестве потенциальных пробиотиков.
Ключевые слова: выделение бифидобактерий, молекулярно-биологическая идентификация, хранение бактерий, устойчивость к стрессам.
DOI: 10.7868/S0026365615030106
В последнее время большое внимание уделяют разработке пробиотических препаратов, в состав которых входят различные микроорганизмы — пробиотики [1]. При создании препарата, помимо пробиотических свойств штаммов, учитывают их способность взаимодействовать с микрофлорой хозяина [2]. Одним из основных компонентов пробиотических препаратов являются бифидобакте-рии, относящиеся к основным представителям нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). К настоящему времени охарактеризованы основные таксономические, морфологические, физиологические свойства бифидобактерий [3, 4], а также изучены особенности качественного и количественного состава бифидобактерий, обитающих в кишечнике в зависимости от возраста, характера питания и климатической зоны проживания человека [5—7].
Известно, что каждый вид бифидобактерий обладает индивидуальными пробиотическими свойствами и оказывает узкоспецифическое влияние на организм человека [8]. Так, B. breve снижает содержание холестерина в крови [9], B. infantis подавляет развитие патогенных микроорганизмов [10], B. longum повышает иммунитет [11]. Универсаль-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kharchenkona-tasha@gmail.com).
ность и, в то же время, специфичность бифидобактерий стали определяющими моментами в развитии индустрии пробиотиков и продуктов функционального питания в последнее время.
Существуют трудности в выделении новых штаммов бифидобактерий. Очень часто рост би-фидобактерий подавляется молочнокислыми бактериями, образующими в большом количестве органические кислоты и антибиотики-бак-териоцины [12]. Существует также проблема длительного и устойчивого культивирования бифи-добактерий в чистых культурах [13].
Задачами данной работы являлись выделение новых штаммов бифидобактерий из экскрементов новорожденных и животных, их идентификация на основе молекулярной диагностики, а также анализ пробиотического потенциала выделенных культур, который заключался в оценке степени устойчивости выделенных штаммов би-фидобактерий к действию гастроэнтерологического стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исходя из физиологических особенностей би-фидобактерий и их природных местообитаний, образцами служили экскременты здоровых новорожденных детей и различных животных.
Таблица 1. Родоспецифичные олигонуклеотидные праймеры, примененные для первичной ПЦР диагностики штаммов Bifidobacterium spp.
Ген Название Последовательность (5'-3') Длина праймера (п.о.) ПЦР-продукт (п.о.) Ссылка
16S рРНК g-Bifid-F CTCCTGGAAACGGGTGG 17 556 Matsuki et al., 2003 [21]
g-Bifid-R GGTGTTCTTCCCGATATCTACA 21
16S рРНК Bif164 GGGTGGTAATGCCGGATG 18 523
Bif662 CCACCGTTACACCGGGAA 18
xfp Xfp-F CGGCTGGCAGTCCAACAA 18 704 Пиксасова, 2009 [22]
Xfp-R GGTTGTTCTTGATGATGTCGG 21
Состав и приготовление сред. Для выделения бифидобактерий использовали жидкую среду следующего состава (г/л): панкреатический гид-ролизат казеина (ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Россия) — 30.0; экстракт пекарских дрожжей (ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Россия) — 5.0; глюкоза — 7.5; лактоза — 2.5; цистеин — 0.5; NaCl — 2.5; MgSO4 — 0.5; аскорбиновая кислота — 0.5; ацетат натрия — 0.3; гидролизат рыбной муки (ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Россия) — 50.0; твин 80 — 1.0 мл; 50%-ный раствор лактулозы — 5.0 мл; гемин — 5 мг. Для получения твердой среды добавляли агар — 15—20 г/л.
Получение накопительных культур. Для получения накопительных культур бифидобактерий 1 г экскрементов помещали в пенициллиновый пузырек с 5 мл стерильной жидкой среды. Пузырек закрывали стерильной резиновой пробкой и зажимали алюминиевым колпачком. Для создания анаэробных условий воздух через шприц замещали стерильным аргоном. Культивирование проводили при 37°C в течение 1—3 суток до появления признаков роста (помутнения, изменения цвета среды, газообразования).
Выделение чистых культур. При выделении чистых культур 0.1 мл полученной накопительной культуры высевали на плотную среду по методу Коха для получения отдельных колоний. Культивирование проводили при 37°С в анаэробных боксах с использованием пакетов Genbox ("BioMerieux", Франция). Для дальнейшей работы отбирали колонии только с характерными для бифидобакте-рий свойствами: грамположительные, оксидазо-и каталазо-отрицательные палочки характерной морфологии. Посев из отдельных колоний осуществляли в пенициллиновые пузырьки с жидкой средой.
Хранение чистых культур. Для длительного хранения клетки культур замораживали при —70°C в обезжиренном молоке с добавлением 5% глюкозы и 5% сахарозы, а затем лиофильно высушивали в Free Zone lyophilizer ("Labconco") при темпе-
ратуре —51°C и давлении 49 кПа в течение 24 ч. Лиофилизированные культуры хранили в холодильнике (4°C).
Молекулярные методы идентификации бифидобактерий. Выделение ДНК из биомассы бактерий проводили согласно методике [14]. Этапу выделения ДНК из клеток предшествовала предобработка материала, которая заключалась в концентрировании клеточной биомассы и отделении ее от культу-ральной жидкости путем центрифугированием в пробирках Эппендорф (8000 g, 5 мин) с последующим декантированием супернатанта. Каждую пробу дважды промывали 1 мл стерильного физиологического раствора для отмывки от среды, которая могла бы обусловливать ингиби-рование ПЦР.
Родоспецифическая полимеразная цепная реакция (ПЦР). С целью проведения первичной идентификации выделенных чистых культур на уровне рода проводили ПЦР, для чего использовали праймеры специфичные для выявления бифидо-бактерий, представленные в табл. 1. Праймеры синтезировали в фирме "Синтол" (Москва, Россия). Реакцию амплификации проводили в реакционной смеси общим объемом 25 мкл, содержащей: 1х ПЦР-буфер ("Fermentas", Литва), включающий KCl и (NH4)2SO4 в количествах, необходимых для эффективной работы Taq-поли-меразы, 3 мМ MgCl2, по 400 мМ каждого из дезокси-нуклеотид трифосфатов, 10 пмолей каждого прайме-ра из трех пар, 10 мкл ДНК-матрицы и 0.3 мкл Taq-полимеразы (0.3 ед. на реакцию). Для проведения реакции использовали ДНК-амплифика-тор GeneAmp 9700 ("Applied BioSystems", США). Температурно-временной профиль реакции был следующим: денатурация ДНК при 95° — 5 мин; ПЦР - (95° - 20 с; 57° - 30 с; 72° - 40 с) - 35 циклов; 72° (4 мин) - конечная элонгация. Температуру гибридизации праймеров с ДНК-матрицей в процессе ПЦР, подбирали согласно индивидуальным свойствам пар праймеров. Эффективность работы использованных пар праймеров анализировали для каждого случая отдельно, после чего было
сделано заключение, что 57°С является одинаково оптимальной температурой для всех трех пар праймеров. Размеры получаемых при ПЦР фрагментов ДНК приведены в табл. 1.
Визуализацию продуктов амплификации осуществляли после проведения электрофореза в 1%-ном агарозном геле при окрашивании интер-калирующим красителем — бромистым этидием (5 мг/мл). В качестве ДНК-маркера использовали стандартный коммерческий препарат #SM0403 ("Fermentas", Литва) с шагом 100 п.н.
Видовая диагностика изолятов по результатам секвенирования гена 16S рРНК. Для проведения полимеразной цепной реакции с целью дальнейшего секвенирования полноразмерных генов 16S рРНК была использована универсальная праймерная система: Univ11F с последовательностью — 5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG и Univ 1492R -5TACGGYTACCTTGTTACGACTT [15]. Амплифи-кационная смесь объемом 50 мкл имела следующий состав: 1х буфер ДНК полимеразы BioTaq [17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 2 мМ MgCl2], по 12.5 нмолей каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмолей соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Россия). Температурно-временной профиль проведения ПЦР был следующим: первый цикл -94°C (9 мин), 55°C (1 мин), 72°C (2 мин); последующие 30 циклов — 94°C (1 мин), 55°C (1 мин), 72°C (2 мин); завершающий цикл элонгации — 72°C (7 мин). Анализ продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 0.8%-ном геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из агарозного геля с применением набора реактивов Wizard PCR Preps ("Promega", США), согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование ПЦР-продуктов. Секвениро-вание полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, проводили по методу Сэнгера и др. [16] с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 ("Applied Biosystems", США) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 ("Applied Biosystems", США) согласно инструкциям производителя. Для секвенирования использовали универсальные праймеры [15], чтение проводили в двух направлениях. Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов путем сравнения с аналогичными последовательностями, размеще
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.