БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2009, том 35, № 6, с. 789-798
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.112.083
НОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ С АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ИЗ МОРСКОЙ АНЕМОНЫ Heteractis crispa
© 2009 г. С. А. Козлов**, Я. А. Андреев*, А. Н. Мурашев**, Д. И. Скобцов**,
И. А. Дьяченко**, Е. В. Гришин*
*Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10;
**Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Московская обл., г. Пущино Поступила в редакцию 09.04.2009 г. Принята к печати 29.04.2009 г.
Из морской тропической анемоны Heteractis crispa комбинацией различных методов хроматографии выделены два новых полипептидных компонента, проявляющих обезболивающий эффект в экспериментах на мышах. Новые полипептиды APHC2 и APHC3 состоят из 56 а.о. с шестью цистеинами. Их полная аминокислотная последовательность была получена по результатам секвенирования методом Эдма-на, масс-спектрометрии и пептидного картирования. Анализ первичной структуры полипептидов позволил отнести их к обширной группе ингибиторов трипсина Кунитца-типа. Интересной биологической функцией новых полипептидов является их анальгетическое действие на млекопитающих, которое, предположительно, осуществляется за счет модулирования активности рецептора TRPV1, а не за счет остаточной ингибирующей активности по отношению к трипсину и химотрипсину. Анальгетическая активность полипептида APHC3, измеренная на модели острой боли "горячая пластина", была значительно выше активности APHC2. Для обоих полипептидов были разработаны методы получения рекомби-нантных аналогов.
Ключевые слова: морская анемона Heteractis crispa; полипептидные ингибиторы типа Кунитца, структура, анальгетическая активность; функциональная экспрессия.
ВВЕДЕНИЕ
Морские анемоны, одни из самых древних хищных животных на земле, распространены преимущественно в теплых морских водах и ведут малоактивный образ жизни, медленно перемещаясь по морскому дну. Анемоны охотятся на мелких рыб, ракообразных и моллюсков, обездвиживая их при помощи стрекательных клеток, расположенных на щупальцах вокруг ротового отверстия. При воздействии на человека эти клетки могут вызвать зуд и жжение, а в месте контакта также возможен некроз тканей. В основном это связано с цитоток-сическим действием основных компонентов ядов -цитолизинов, на мембраны клеток млекопитающих [1]. Помимо мембранолитических компонентов, в ядах анемон был обнаружен целый ряд полипептидов с разнообразной биологической активностью. Прежде всего, это нейротоксины,
Сокращения: ASIC - протончувствительный канал; BPTI -бычий панкреатический ингибитор трипсина (bovine pancreatic trypsin inhibitor); TRPV1 - ваниллоидный рецептор 1; IPTG - изопропил-Р-О-1-тиогалактопиранозид; TFA - три-фторуксусная кислота; EDTA - этилендиаминтетрауксус-ная кислота.
# Автор для связи (тел.: (495) 336-65-40; факс: (495) 330-7301; эл. почта: serg@ibch.ru).
способные при низких концентрациях вызывать паралич потенциальных жертв.
Из экстрактов анемон были выделены и охарактеризованы многочисленные полипептидные токсины, селективно взаимодействующие с сайтом 3 узнавания №+-каналов (замедляющие кинетику инактивации канала). Характерные особенности первичной структуры позволили выделить три типа блокаторов №+-каналов [2, 3]. Первые два типа составляют токсины длиной 40-50 а.о., а токсины третьего типа более короткие - 27-32 а.о. По своей физиологической активности они более специфичны по отношению к №+-каналам ракообразных и насекомых, чем к каналам млекопитающих [4]. Усилению паралитического эффекта способствуют продуцируемые анемонами блокаторы К+-каналов. Эти полипептидные токсины, подобно цитолитиче-ским компонентам, также разделяются на четыре структурные группы [2, 5]. Первый тип включает токсины BgK и ShK [6, 7], длиной в 35-37 а.о. с тремя дисульфидными связями; второй тип объединяет полипептидные токсины каликлюдины [8], структурные гомологи ингибиторов протеиназ типа Кунитца; к третьему типу относятся блокаторы BDS-I и BDS-П длиной в 40 а.о., обладающие структурным сходством с токсинами анемон, влияющими на №+-
каналы [9]. Наконец, самые небольшие токсины длиной в 28 а.о. с 2 дисульфидными связями, SHTX I и SHTX II [10], относятся к четвертому типу.
Кроме токсических компонентов анемоны способны продуцировать небольшие полипептидные молекулы, не вызывающие гибель или паралич жертв. Так, например, из различных видов анемон были выделены ингибиторы протеолитических ферментов [11-13]. Для токсинов и пептидных ингибиторов характерна одинаковая пространственная укладка. Кроме того, каликлюдины 1-3 [8] и ингибитор протеиназ SHTX III [10] проявляют ингибиру-ющую активность в отношении как потенциалакти-вируемых К+-каналов, так и сериновых протеиназ.
Помимо нейтральных и токсичных компонентов анемоны продуцируют полипептидные компоненты с обезболивающим действием. По-видимому, это связано с тем, что генерируемая ими природная комбинаторная библиотека полипептидов направлена на максимально возможное воздействие на любые типы нейрональных и мышечных ионо-тропных рецепторов. Блокирование или изменение характеристик проведения сигнала (модулирование действия) ряда таких рецепторов приводит к аналь-гетическому эффекту. Эффект обезболивания при введении полипептидов анемон на животных моделях наблюдали для APETx1 - селективного блока-тора протончувствительных каналов ASIC3 [14] и для APHC1 - модулятора активности ваниллоидно-го рецептора TRPV1 [15].
В настоящей работе приводятся данные о структуре и биологической активности двух новых полипептидных компонентов, выделенных из спиртового экстракта морской анемоны Heteractis crispa, проявляющих обезболивающий эффект.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что ионотропные рецепторы TRPV1 принимают прямое участие в механизмах восприятия передачи болевого сигнала. Так, эксперименты с нокаутными мышами показали, что отсутствие этого рецептора приводит к значительному повышению порога болевой чувствительности к тепловым и воспалительным стимулам [16]. Антагонисты TRPV1, по-видимому, могут облегчать боль при ряде патологических состояний организма. Исследования низкомолекулярных ингибиторов TRPV1 подтверждают, что фармакологическая блокада этого рецептора может быть использована в терапии болей, возникающих при воспалении, раке и нейропатии [17, 18]. В первую очередь поиск новых анальгетических компонентов из экстрактов анемон был ориентирован на выделение ингибиторов рецептора TRPV1.
Полипептидные компоненты с анальгетической активностью были выделены из спиртовой фракции тропического вида анемоны H. crispa комбина-
цией методов жидкостной хроматографии. Предварительные стадии разделения гидрофобной хроматографией на Полихроме-1 и ионообменной хроматографией на колонках Bio-Rex 70 и SP-Sephadex G-25 соответствовали ранее описанным [19], использовавшимся при выделении модулятора ваниллоидного рецептора APHC1. Тогда же в электрофизиологических экспериментах была замечена незначительная ингибирующая активность минорной фракции, элюирующейся после основного активного компонента, на капсаицининдуцируе-мый ток через каналы TRPV1. Для идентификации активных компонентов этой фракции, полученной после ионообменной хроматографии на SP-Sepha-dex G-25, применяли обращенно-фазовую ВЭЖХ (рис. 1). Первоначальное хроматографическое разделение в кислых буферных системах, содержащих 0.1% TFA (данные не приводятся), оказалось неэффективным, поэтому мы использовали нейтральные значения рН буферных растворов, что позволило получить лучшее разрешение отдельных хро-матографических пиков.
В модельных экспериментах на животных две фракции, собранные в процессе ВЭЖХ, проявляли анальгетическую активность. Первая содержала наиболее представленный полипептидный компонент APHC1 (время удерживания на колонке 34 мин), вторая содержала новый полипептидный компонент (время удерживания 43 мин). После дополнительной очистки на обращенно-фазовой колонке Luna C18 2 х 150 мм основной компонент этой фракции (APHC2) был выделен в индивидуальном состоянии. По данным MALDI-масс-спектромет-рии, молекулярная масса компонента составила 6185 Да, что всего на 2 Да менее молекулярной массы анальгетического пептида APHC1. Столь незначительное различие в молекулярных массах двух активных компонентов может свидетельствовать об одной или нескольких заменах аминокислотных остатков в структуре полипептида или о возможном амидировании С-концевого аминокислотного остатка (с учетом ошибки измерения линейного режима масс-спектрометра +\-1 Да). Первоначально, версия с амидированием полипептида казалась более предпочтительной, так как для компонентов природных ядов такая модификация является распространенной [20].
Определение частичной N-концевой аминокислотной последовательности алкилированного 4-ви-нилпиридином полипептида APHC2 выявило первые 23 а.о., полностью совпадающих с N-концевой последовательностью APHC1 (рис. 2).
Для идентификации фрагмента молекулы APHC2 с возможными заменами проводили пептидное картирование алкилированного белка. Анализ молекулярных масс триптических пептидов выявил только один пептид из центральной части молекулы, отличающийся на 2 Да от соответствующих
a210' мВ 300
200 -
100 -
30
45
Время, мин
60
70
Рис. 1. Хроматографическое разделение фракции ингибиторов TRPVl-рецептора на колонке Jupiter C5 (Phenomenex) 4.6 х 150 мм. Элюцию фракций со скоростью 1.5 мл/мин проводили в линейном градиенте: 0—100% раствора Б в А за 105 мин, где раствор А - 10 мМ аммонийацетат (рН 7.2), раствор Б - 70% CH3CN в растворе А. Фракция, содержащая полипептид APHC2, заштрихована.
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
56
GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYFDSETGKCTVFIYGGCEGNGNNFETLRACRAICRA
APHC1 APHC2 APHC3
Ингибитор IV GSICLEPKVVGPCTAYFPRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNSYVDEKLHACRAICRA SHPI-1 SHPI-2
GSICLEPKVVGPCTAYFRRFYFDSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLRACRAICRA GSICLEPKVVGPCTAYFPRFYFNSETGKCTPFIYGGCEGNGNNFETLRACRGICRA
SICSEPKKVGRCKGYFPRFYFDSETGKCTPFIYGGCGGNG
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.