БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2009, том 35, № 6, с. 444-449
УДК 577.112.8 ФАРМАКОЛОГИЯ
НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ХИТОЗАНА С ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
© 2009 г. Г. А. Набережных, С. И. Бахолдина, В. И. Горбач, Т. Ф. Соловьева
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток 690022 e-mail: naber1953@mail.ru
Статья принята к печати 15.09.2009 г.
Синтезированы водорастворимые производные хитозана, различающиеся по молекулярной массе, гидро-фобности и заряду; изучена их активность против грамотрицательных и грамположительной бактерий. Показано, что исследуемые соединения способны обеспечивать проникновение бромистого этидия внутрь бактерий, что указывает на увеличение проницаемости клеточных оболочек под действием хитозанов. Устойчивость грамотрицательных и грамположительной бактерий к разным производным хитозана оказалась неодинаковой. Грамотри-цательные бактерии наиболее чувствительны к высокомолекулярному хитозану, а грамположительная - к N-,O-карбоксипропилхитозану, в то время как высокомолекулярный хитозан действовал на нее слабо. Изучение взаимосвязи между структурой и активностью исследуемых соединений показало, что деполимеризация хитозана уменьшает, а введение в молекулу хитозана гидрофобных заместителей существенно увеличивает его дестабилизирующее действие на клеточные оболочки бактерий. Полученные результаты могут служить основой для конструирования новых производных хитозана с антимикробной активностью.
Ключевые слова: хитозан, производные хитозана, бактерии, проницаемость оболочек.
New chitosan derivatives with potential antimicrobial activity. G. A. Naberezhnykh, S. I. Bakholdina, V. I. Gorbach, T. F. Solov'eva (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690022)
A series of 4 water-soluble chitosan derivatives differing in molecular mass, hydrophobicity, and charge was obtained and examined for activity against both gram-negative and gram-positive bacteria. The tested compounds were able to provide penetration of ethidium bromide into the bacteria, indicating increased permeability of the bacterial membranes under the effect of chitosans. The gram-negative and gram-positive bacteria showed different resistance to the permeabilizing effect induced by the structurally distinct chitosans. Gram-negative bacteria were most sensitive to high molecular chitosan. N-,O-Carboxypropylchitosan produced the greatest effect on the gram-positive bacterium, while high molecular chitosan had a limited effect on it. The study of the relationship between the structure and activity of the tested compounds showed that the introduction of hydrophobic substitutes in the molecular chain of chitosan significantly enhanced its permeabilizing activity but the depolymerization of chitosan markedly reduced its disorganizing effect on the bacterial cell membranes. The results obtained provide a basis for the construction of new chitosan derivatives with antimicrobial activity. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2009, vol. 35, no. 6, pp. 444-449).
Key words: chitosan, chitosan derivatives, bacteria, membrane permeability.
Хитин - широко распространенный в природе биополимер, который является главным структурным компонентом ракообразных, насекомых, моллюсков и грибов. Ежегодное накопление хитина только в Мировом океане оценивается в 2.3 млрд. тонн (Немцев, 2006). Основным источником для получения хитина служат панцири морских ракообразных - отходы переработки исходного сырья (Немцев, 2006). Хитин привлекает внимание исследователей благодаря комплексу полезных химических и биологических свойств и возобновляемой сырьевой базе, однако его использование ограничено из-за полной нерастворимости в воде (Нудьга, 2002). В настоящее время самым распространенным производным хитина является водорастворимый (при слабо кислых рН) катионный полиэлектролит - хитозан. Благодаря таким свойствам, как биоразла-гаемость, биосовместимость и отсутствие токсичности, хитозан нашел применение в биотехнологии, медицине, пищевой и фармацевтической промышленности (Singla, Chawla, 2001). Актуальной задачей представляется по-
лучение на основе этого биополимера новых наукоемких продуктов, обладающих высокими потребительскими качествами.
Антимикробная активность хитозана обнаружена достаточно давно, но исследования в этом направлении продолжаются (Rabea et al., 2003). Применение хитозана в медицине ограничено из-за его нерастворимости в нейтральных и щелочных растворах, из-за высокой вязкости кислых растворов и плохой всасываемости в желудочно-кишечном тракте. В связи с этим ведутся поиски новых нетоксичных производных хитозана, обладающих антимикробной активностью и имеющих подходящие физико-химические свойства. Кроме хитозана, исследованы антибактериальные свойства целого ряда его производных: N-гидроксипропилхитозана (Xie et al., 2002), карбоксиметилхитозана (Liu, 2001), N-кар-боксибутилхитозана (Muzzarelli et al., 1990) и синтетических разветвленных хитозанов (Kurita et al., 2000).
Молекулярные механизмы антимикробной активности хитозана и его производных в настоящее время
полностью не установлены. Считается, что действие хитозана на микроорганизмы является комплексным. На начальном этапе хитозан, подобно другим бактерицидным поликатионам, связывается за счет электростатических взаимодействий с отрицательно заряженными компонентами на поверхности бактерии (Helander et al., 2001; Raafat et al., 2008). Это изменяет проницаемость стенки бактерии и открывает доступ хитозана к внутренним клеточным мишеням, что приводит к прекращению деления клеток или к их гибели (Je, Kim, 2006).
В данной статье представлены результаты изучения влияния хитозана и его водорастворимых производных, различающихся между собой по молекулярной массе, заряду и гидрофобности, на проницаемость наружных оболочек грамположительных и грамотрица-тельной бактерий с целью поиска новых производных хитозана с высокой антибактериальной активностью и выяснения молекулярных механизмов антибактериального действия хитозана.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В работе использовали бактерии Escherichia coli К-12 (штамм 3254), E. coli M-17, Yersinia pseudotuberculosis (штамм KS 3058) и Staphylococcus aureus (штамм 906). Бактерии выращивали в аэробных условиях в колбах на качалке (180 об/мин) на питательном бульоне (ПБ, Оболенск) и питательном бульоне с добавлением 0.5% галактозы (ПБ+Gal). E. coli и S. aureus культивировали в течение 24 ч при 37°С, Y. pseudotuberculosis - в течение 6 сут при 8°С. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием и отмывали физиологическим раствором (0.9% NaCl).
Выделение и характеристику суммарной фракции фос-фолипидов Y. pseudotuberculosis проводили, как описано ранее (Бахолдина и др., 2001).
ДСН-ПААГ-электрофорез лизатов клеток и окрашивание липополисахаридов (ЛПС) ионами серебра выполняли по известной методике (Tsai, Frasch, 1982).
Хитозан и производные хитозана получали предложенными ранее методами (Иванушко и др., 2007; Набережных и др., 2008). Коммерческий хитозан, полученный щелочной обработкой хитина крабов, со степенью N-ацетилирования (СА) 17% дезацетилировали в смеси водная щелочь - изопропило-вый спирт в течение 7 ч при температуре 100°С. В результате получали высокомолекулярный хитозан (Х-ВМ) с молекулярной массой (Мв) 80 кДа, определенной методом вискозиметрии, СА 1.8%. Деполимеризацией Х-ВМ перекисью водорода (1.7%), осаждением изопропиловым спиртом и ультрафильтрацией на мембране с пределом эксклюзии 3 кДа получали низкомолекулярный хитозан (Х-НМ) со средней Мв 5.5 кДа. Х-НМ ацилировали N-гидроксисукцинимидным эфиром 3-гидрокситетрадекановой кислоты в смеси растворителей вода - ^^диметилфорамид в течение 48 ч при 37°С. Полученные производные очищали обратнофазовой хроматографией на сорбенте Octadecyl Si100-Polyol ("Serva", Германия). В результате были получены производные, которые по данным 'Н и 13С-ЯМР спектроскопии и MALDI-TOF масс-спект-рометрии содержат один остаток 3-гидрокситетрадекановой кислоты (3-OH-C14) на восстанавливающем конце молекулы и имеют общую формулу (GlcNH2)n - (GlcNH)-3-OH-C14. N-,O-Карбоксипропилхитозан был синтезирован алкилированием Х-ВМ в щелочной среде омега-галогенпроизводным бутано-вой кислоты. Степень замещения амино- и гидроксигрупп составила 65%.
Для оценки проницаемости бактериальных клеток был использован флуоресцентный краситель бромистый этидий, который не проникает в интактные клетки (Zorko et al., 2005). Анализ проводили в лунках 96-луночного планшета. Предварительно в лунках планшета готовили ряд двукратных разведений хитозана или его производных в 0.05 М ацетатном буфере (рН 5.5) по 0.05 мл в концентрации 4 мг/мл. Затем в каждую лунку добавляли 0.05 мл бромистого этидия (30 мкМ) и 0.1 мл суспензии бактерий в физиологическом растворе в концентрации 108 кл/мл. Регистрацию изменений флуоресценции (возбуждение при 530 нм, испускание при 590 нм) проводили на спектрофлуориметре FL-600 ("Bio-Tek", США) через каждые 30 мин в течение 6 ч. Повреждающее действие исследуемых веществ анализировали при одной концентрации, рассчитывая интенсивность флуоресценции красителя в относительных единицах и принимая за максимальную величину флуоресценцию клеток, лизированных многократным замораживанием-оттаиванием. В качестве нулевого контроля использовали нативные бактерии без добавления хитозанов. Каждое определение проводили в трех независимых опытах; диапазон экспериментальных ошибок не превышал 5-8%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе использовали хитозан (Х-ВМ) и его производные: низкомолекулярный хитозан (Х-НМ), кар-боксипропилхитозан (Х-КП), N-ацилированный Х-НМ, которые значительно различаются между собой по молекулярной массе, заряду и гидрофобности. Широкий набор поликатионов с различными свойствами позволяет оценить влияние их структуры на связывание с бактериями и на проницаемость бактериальных мембран, а также приблизиться к пониманию механизмов антимикробного действия хитозанов и других поликатионов.
Для исследования изменений проницаемости б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.