МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 4, с. 632-641
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА :
УДК 577.152.3
НОВЫЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ F-Tfll, F-Tflll И F-TfllV, КОДИРУЕМЫЕ БАКТЕРИОФАГОМ Т5
© 2004 г. Н. В. Акуленко12, Т. В. Ивашина12, Л. А. Шалойко13, М. Г. Шляпников2, В. Н. Ксензенко1*
1Институт белка Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 2Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук,
Пущино, Московская обл., 142290 3Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 Поступила в редакцию 24.12.2003 г.
Обнаружены новые сайт-специфические эндонуклеазы F-Tfll, F-TflII и F-TfllV, относящиеся к семейству H-N-H. Они кодируются открытыми рамками считывания, расположенными в области генов тРНК бактериофага Т5. Показано, что эндонуклеаза F-TflV вносит двухцепочечный разрыв в псевдопалиндромную последовательность ДНК длиной в 17 п.н., образуя 3'-выступающие концы из одного нуклеотида. В отличие от F-TfllV, эндонуклеазы F-Tfll и F-Tflll вносят одноцепочечные разрывы в несимметричные сильновырожденные последовательности ДНК, причем каждая из них -только в одну цепь (матричную или кодирующую). Анализ аминокислотных последовательностей исследуемых эндонуклеаз показал, что они обладают высокой гомологией в области H-N-H-мотива и С-концевой последовательности, формирующих предполагаемый каталитический домен. N-ко-нец эндонуклеазы F-TfllV гомологичен последовательности, образующей НТН-домен LuxR-семей-ства транскрипционных регуляторов, который отвечает за связывание и узнавание ДНК. В N-кон-цевой последовательности эндонуклеаз F-Tfl и F-Tfll выявлен составной мотив NUMOD4, обнаруживаемый также в предполагаемых узнающих доменах определенной группы H-N-H-эндонуклеаз. Высказано предположение о двухдоменной структуре эндонуклеаз F-Tfll, F-Tflll и F-TflV - с N-кон-цевым узнающим и С-концевым каталитическим доменами, а также об их эволюционном происхождении путем рекомбинации каталитического и узнающих доменов.
Ключевые слова: бактериофаг Т5, H-N-H-эндонуклеазы, сайты узнавания, узнающий домен, бесклеточная система трансляции, генная конверсия.
NOVEL SlTE-SPEClFlC ENDONUCLEASES F-Tfll, F-Tflll AND F-TfUV ENCODED BY THE BACTE-RlOPHAGE T5, by N. V. Akulenko1, 2, T. V. Ivashina12, L. A. Shaloiko1, 3, M. G. Shlyapnikov2, V. N. Ksenzenko1* (institute of Protein Research, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, 142290 Russia; 2Skryabin lnstitute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, 142290 Russia; 3Branch of Shemyakin and Ovchinnikov lnstitute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, 142290 Russia; *e-mail: ksenzenko@ve-ga.protres.ru). Novel site-specific H-N-H endonucleases F-Tfll, F-Tfll and F-TflV were identified. These en-donucleases are encoded by open reading frames localized in the bacteriophage T5 tRNA gene region. The endonuclease F-TflV was shown to introduce double-strand break into pseudo palindromic 17 bp DNA sequence yielding 1 bp extensions with 3'-overhangs. ln contrast to F-TfllV, endonucleases F-Tfll and F-Tfll cleave only one strand of their asymmetric divergent DNA substrates. Each of these endonucleases introduces interruptions into only the particular strand (template or coding). Amino acid sequences of the endonucleases under study are highly homologous in the H-N-H motif regions and C-terminal sequences, forming putative catalytic domain. Endonuclease F-TflV N-terminal region is homologous to the amino acid sequences representing H-T-H recognition domain found in LuxR family transcription regulators. Putative recognition NUMOD4 motif characteristic for a number of H-N-H endonucleases was shown to be also present in the endonuclease F-Tfll and F-Tfll N-terminal sequences. Two-domain structure was proposed for endonucleases F-Tfl, F-Tflll and F-TfllV with N-terminal recognition domain and C-terminal catalytic domain. A hypothesis of evolutionary origin of these endonucleases as a result of catalytic and recognition domains recombination was suggested.
Принятые сокращения: ОРС - открытая рамка считывания; НТО - нетранслируемая область; п.н. - пары нуклеотидов; Н-К-Н-эндонуклеазы - эндонуклеазы, в аминокислотной последовательности которых присутствует Н-К-Н-мотив; НТН (ЪеИх-Шгп-ИеИх) - "спираль-поворот-спираль"; РНП - рибонуклеопротеид; КТР - нуклеозид-5'-трифосфат; ПААГ - поли-акриламидный гель.
*Эл. почта: ksenzenko@vega.protres.ru
В составе интронов типов I и II обычно присутствуют ОРС, кодирующие сайт-специфические эндонуклеазы, которые инициируют процесс переноса интрона с фланкирующими его участками ДНК в аллель гена, лишенный данного интрона [1-3]. Этот процесс, один из вариантов процесса генной конверсии, получил название "homing" (в переводе - возвращение домой), а инициирующие его эндонуклеазы - эндонуклеаз генной конверсии ("homing endonucleases"). ОРС, кодирующие эндонуклеазы генной конверсии, могут располагаться также вне интронов [4-6]. Они, как это показано на примере некоторых кодируемых фагом T4 эндонуклеаз, инициируют процесс, подобный процессу "homing" [4-6].
Характерной особенностью эндонуклеаз генной конверсии является то, что они узнают протяженные (12-40 п.н.), часто асимметричные, вырожденные последовательности ДНК [1-3]. Как правило, эти эндонуклеазы вносят двухцепочеч-ный разрыв в ДНК недалеко от места вставки интрона, образуя 3'-выступающие концы длиной из 2-4 нуклеотидов. Эндонуклеазы генной конверсии встречаются у бактериофагов, эубактерий, архей и эукариот [1-3]. На основании имеющихся в аминокислотных последовательностях этих ферментов специфических мотивов их подразделяют на 4 семейства: "LAGLIDADG", "GIY-YIG", "His-Cys box" и "H-N-H" [1-3].
H-N-H-семейство объединяет наименее изученные в структурном и функциональном отношении эндонуклеазы, в которых имеется мотив из 30-33 аминокислотных остатков с двумя парами консервативных остатков гистидина, фланкирующих остаток аспарагина [7, 8]. Большинство H-N-H-эндонуклеаз обладает уникальными свойствами, отличающими их от типичных эндонуклеаз генной конверсии. Так, например, при гидролизе ДНК эндонуклеазой I-TevIII Т4-подобного фага RB3 образуются 5'-выступающие концы, а при гидролизе всеми другими эндонуклеазами генной конверсии - 3'-выступающие концы [9]. В состав H-N-H-семейства также входит необычная группа эндонуклеаз, вносящих одноцепочеч-ные разрывы в ДНК. Это эндонуклеаза I-TwoI фага Twort Staphylococcus aureus, эндонуклеаза I-HmuI фага SP01 Bacillus subtilis, эндонуклеаза I-HmuII фага SP82 B. subtilis и эндонуклеаза I-BasI фага Bastille Bacillus thuringiensis [10-12]. Особенность функционирования H-N-H-эндонуклеаз, кодируемых интронами типа II, заключается в том, что перенос интрона способны катализировать только РНП-частицы, состоящие из белка, кодируемого интроном, и интронной РНК, образующейся в процессе сплайсинга [13, 14]. Наиболее изучены эндонуклеазы, кодируемые интронами aI1 и aI2 митохондриального гена COX1 Saccharo-myces cerevisiae, и белок LtrA, кодируемый интроном Ll.LtrB Lactococcus lactis [15-17]. Следует отметить, что H-N-H-мотив присутствует также в
аминокислотных последовательностях других классов нуклеаз: у метилцитозин-специфичной эндонуклеазы рестрикции McrA из Escherichia coli, у фермента системы репарации Sgmt-MutS из митохондрий коралла Sarcophyton glaucum, а также у колицинов Е2 и Е7-Е9 [7, 8, 18].
В настоящей работе представлены доказательства того, что три ОРС из области генов тРНК бактериофага Т5, нуклеотидная последовательность которых определена ранее, кодируют сайт-специфические эндонуклеазы F-TflI, F-TflII и F-TfllV, относящиеся к H-N-H-семейству. Высказывается предположение о доменной организации и возможном происхождении этих белков.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериофаг Т5 любезно предоставлен В.И. Таняшиным (ИБФМ им. Т.К. Скрябина РАН), бактериофаг BF23 - К. Хеллером (K. Heller, Federal Dairy Research Centre, Kiel, Germany) и бактериофаг 5 Salmonella heidelberg - Х. Аккерманом (H. Ackermann, Laval University Quebec, Canada).
Нуклеотидную последовательность ДНК определяли, используя набор "fmol DNA Sequencing System" ("Promega", США). В этих опытах матрицами служили ПЦР-фрагменты, синтезированные с использованием специфических праймеров. Нуклеотидные последовательности областей генов тРНК бактериофагов Т5, BF23, а также бактериофага 5 S. heidelberg зарегистрированы в базах данных нуклеотидных последовательностей EMBL/GenBank/DDBJ под соответствующими номерами: AJ85756, AJ604530 и AJ604531.
Аминокислотные последовательности эндонуклеаз F-Tfll, F-TfZII и F-TflIV анализировали, используя следующие алгоритмы и базы данных: BLASTP (http://www.ebi.ac.uk/blast2/, сравнение с базой данных аминокислотных последовательностей UniProt) [19], CLUSTAL W1.8 (множественное выравнивание аминокислотных последовательностей) [20], InterPro (интегрированная база белковых сайтов и доменов) [21]. Вторичную структуру эндонуклеаз F-TflI и F-TflII предсказывали с использованием программы PsiPred [22].
Праймеры метили 32P с помощью полинуклео-тидкиназы фага Т4 ("Promega", США) согласно рекомендациям фирмы-поставщика. [y-32P] ATP получали из ТУП ТНЦ РФ физико-энергетического института им. Лейпунского.
Фрагменты ДНК, используемые в дальнейшем в качестве матрицы для транскрипции in vitro, получали с помощью трехпраймерной ПЦР. Для амплификации каждой из ОРС использовали универсальный праймер (A) и пару специфических праймеров, комплементарных соответственно матричной и кодирующей цепям ДНК: праймеры B и E (в случае гена hegA), праймеры C и G (hegC), праймеры D и I (hegD). Структура прайме-ров приведена в конце раздела. Идентичные участки в составе универсального праймера и прай-
меров B, C и D выделены жирным шрифтом. В реакционную смесь универсальный праймер, а также праймеры, комплементарные соответственно кодирующей и матричной цепя
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.