ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 631.523.5:638.12
НОВЫЕ SNP МАРКЕРЫ В ГЕНЕ ВИТЕЛЛОГЕНИНА Vg МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Apis mellifera mellifera L.
© 2015 г. Р. А. Ильясов, А. В. Поскряков, А. Г. Николенко
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа 450054
e-mail: apismell@hotmail.com Поступила в редакцию 16.06.2014 г.
Сохранение генофонда медоносной пчелы подвида A. m. mellifera чрезвычайно важно для успешного развития пчеловодства в северных регионах Евразии. Генотипирование пчелиных семей на современном этапе развития науки очень эффективно проводить на основе сайтов однонуклеотидных замен (SNP). Ген вителлогенина (Vg) медоносной пчелы, кодирующий белок, участвующий в регуляции размножения, поведения, иммунитета, продолжительности жизни и социальной организации особей медоносной пчелы Apis mellifera, представляет большой интерес для изучения. В результате сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена Vg медоносной пчелы мы обнаружили 26 SNP, дифференцирующих пчел эволюционных ветвей М и С, которые могут быть использованы в качестве генетических маркеров в селекции подвида A. m. mellifera, в проведении генетического штрихкодирования и создании генетического паспорта пчелиных семей.
DOI: 10.7868/S0016675815020083
Вид медоносной пчелы Apis mellifera L. в ходе длительной эволюции был генетически подразделен на 30 подвидов, географически изолированных в естественном ареале [1]. Дивергенция не обеспечивает генетической изоляции, и пчелы разных подвидов подвержены гибридизации на границах их ареалов. Развитие пчеловодства усилило процесс гибридизации благодаря транспортным перевозкам пчел одних подвидов в ареалы других. Гибридные пчелы, к сожалению, не могут быть успешно использованы в селекции по хозяйственно полезным и биологическим признакам по причине сложности контроля над процессом скрещивания — одна матка способна скрещиваться в полете с более 12 разными трутнями. Искусственное оплодотворение матки не способно решить все проблемы селекции, так как рабочие особи часто не принимают такую матку и заменяют ее своей, заново выведенной, маткой. С другой стороны, искусственное оплодотворение негативно влияет на здоровье матки и качество откладываемых яиц — не все яйца оказываются оплодотворенными, в результате чего в семье может увеличиться численность трутней, выращиваемых из неоплодотворенных яиц.
Считается, что пчеловодство может быть успешным лишь при разведении пчел одного подвида в регионе. Западная и Северная Евразия — аборигенный ареал медоносной пчелы подвида Apis mellifera mellifera. Этот подвид пчелы, относящийся к эволюционной ветви М, чрезвычайно важен для северного пчеловодства, так как идеально приспособлен к жизни в условиях резко-
континентального климата с продолжительными суровыми зимами [2].
На данный момент в результате хозяйственной деятельности человека остатки популяции этого северного подвида медоносной пчелы сохранились в виде небольших островков в России, Швейцарии, Дании, Швеции, Норвегии, Франции и Испании [3, 4]. Для успешной селекции и воспроизведения А. т. те1^ега необходимы сохранение генетической чистоты генофонда и контроль подвидовой принадлежности экспортируемых и импортируемых пчелиных семей. Методы диагностики подвидов пчел, основанные только на анализе параметров хитиновых частей тела, полиморфизма микросателлитных локусов, а также структуры межгенного локуса С01-С011 мтДНК [5], малопригодны в условиях интенсивной гибридизации. В селекции и систематике в современном пчеловодстве очень эффективны маркеры на основе однонуклеотидных замен (8МР) [6]. У медоносной пчелы по одним данным известно 1136 [6], а по другим данным 1183 8МР [7], разбросанных по всему геному, которые используются в идентификации подвидов, определении уровня интрогрессии и селекции пчел во всем мире.
Для поиска 8МР, дифференцирующих А. т. те1-Щега от пчел эволюционной ветви С, нами был выбран ген кодирующий основной предшественник яичного желтка медоносной пчелы ви-теллогенин, который представляет собой мономерный фосфолипогликопротеин высокой плотности с молекулярной массой 180 кДа [8—10]. В
литературе описывается плейотропное действие вителлогенина, приводящее к различным фено-типическим проявлениям у пчелиной матки и рабочих особей медоносной пчелы [11]. Известно, что титр вителлогенина в гемолимфе медоносной пчелы положительно коррелирует с величиной яйценоскости матки [12]. Показано, что вителло-генин играет важную роль в развитии кастовой дифференциации медоносной пчелы [13, 14]. У пчел вителлогенин синтезируется в жировом теле, секретируется в гемолимфу и накапливается в ооцитах, обеспечивая в дальнейшем питание эмбриона [10].
В геноме медоносной пчелы встречается только одна копия гена вителлогенина (Vg), тогда как у некоторых видов насекомых содержится несколько [15]. У медоносной пчелы ген Vg состоит из 7 эк-зонов, нуклеотидные последовательности которых, кроме 1-го экзона, опубликованы в международном генетическом банке ОепВапк [16].
Наша работа на основе сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена Vg медоносной пчелы была выполнена с целью обнаружения новых, ранее не известных 8МР, которые могут быть использованы в пчеловодстве в качестве генетических маркеров для дифференцирования пчел эволюционных ветвей М и С. Данные 8МР, несомненно, будут полезны для селекции чистых линий медоносной пчелы подвида А. т. те1-И/ега, проведения генетического штрихкодирова-ния и создания генетического паспорта семей на пасеках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследования были отобраны 12 рабочих пчел из разных пчелиных семей с пасек, расположенных в ареалах генетических изолятов подвида А. т. теШ/ега: д. Кагарманово, сёл Кага и Серме-нево Белорецкого района, деревень Галиакберо-во, Яумбаево и Иргизлы Бурзянского района, Ку-старевка, Сабанчи и Уядыбаш Татышлинского района республики Башкортостан (РБ), Нытва Нытвенского района и двух пасек в д. Поршакова Красновишерского района Пермского края (ПК). Пчелы проверялись на принадлежность к подвиду А. т. теШ/ега по структуре межгенного локуса С01-С011 мтДНК и спектрам аллелей 9 микроса-теллитных локусов: Ар243, 4а110, А24, А8, А43, А113, А88, Ар049 и А28 [2, 3, 5].
ДНК экстрагировали из ткани грудных летательных мышц медоносной пчелы, используя набор для выделения ДНК "ДНК-ЭКСТРАН 2" (Синтол) [17].
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторе Терцик МС2 в 15-мкл реакционной смеси, содержащей 1и Taq-ДНК полимеразы, 2—4 мМ М§804, 200 мкМ каждого
Таблица 1. Праймеры для ПЦР экзонов гена Vg медоносной пчелы Apis mellifera [15]
Экзон Праймер
2 F 5'-tcttgttcgttccaggttcc-3'
R 5'-gacagtttcagccgacttcc-3'
3 F 5'-cctttcgatccattccttga-3'
R 5'-gtcaaaacggattggtgctt-3'
4 F 5'-tcgaaggggaagaatttcaa-3'
R 5'-acgagcaattcctcaacacc-3'
5 F 5'-gtcggacaatttcacgtcct-3'
R 5'-gttcgagcatcgacacttca-3'
6 F 5'-agagccagggatacgtcaaa-3'
R 5'-gagtcatctcgaggctcacc-3'
7 F 5'-ttctggctgaggtcaggatt-3'
R 5'-aatttcgaccacgactcgac-3'
dNTP, 0.5 мкМ каждого праймера и 20—100 нг ДНК. Для ПЦР и секвенирования 6 экзонов (со 2-го по 7-й) гена Vg были использованы олигонуклео-тидные праймеры, представленные в табл. 1. Первый экзон гена Vg не анализировался в связи с отсутствием данных в GenBank, необходимых для проведения сравнительного анализа по этому экзо-ну. Амплификаты очищались и секвенировались на автоматическом секвенаторе 'APPLIED BIOSYSTEMS" в компании Синтол.
Полученные нуклеотидные последовательности гена Vg были проанализированы с использованием компьютерной программы MEGA 4.1. Нуклеотидные последовательности выравнивали относительно референсной нуклеотидной последовательности гена Vg Apis mellifera, опубликованной в генетическом банке (LG4; NC_007073.3 (4020743-4026919); AADG06005159.1 (5657362749)), первый нуклеотид стартового кодона которой соответствовал положению 4020743 четвертой хромосомы LG4 медоносной пчелы [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Просеквенированные в ходе наших исследований нуклеотидные последовательности шести эк-зонов гена Vg пчел из уральского региона были депонированы в базу данных ОепВапк под следующими номерами: 2-й экзон (Ю572309— Ю572320), 3-й экзон (Ю645883-Ю645894), 4-й экзон (Ю572297-Ю572308), 5-й экзон (Ю572285-Ю572296), 6-й экзон (Ю532136-Ю532147), 7-й экзон (Ю532124—Ю532135). Все изученные рабочие пчелы были гомозиготны по гену Vg. Всего в ОепВапк нами были депонированы 72 нуклеотид-ные последовательности по проанализированным шести экзонам гена Vg медоносной пчелы.
Таблица 2. Сайты нуклеотидных замен гена у пчел из уральского региона относительно референсной последовательности из GenBank
Образцы
Экзон 2
Экзон 3
Экзон 4
Экзон 5
сайты замен
526 574 1373 1418 1793 2443 2458 3978 4528 4533
Reference sequence Vg GenBank A A T A T T T C C G
Башкортостан
Белорецкий, д. Кагарманово G G C A T С С C C G
Белорецкий, с. Кага G G C A T T T C C G
Белорецкий, с. Серменево G G C A T С T C C G
Бурзянский, д. Галиакберово G G C G T T T T A* G
Бурзянский, д. Яумбаево G G C A C С С C A* C**
Бурзянский, д. Иргизлы G G C A T T T C C G
Татышлинский, д. Кустаревка A A C A T T T C C G
Татышлинский, д. Сабанчи G G C A T T T C C G
Татышлинский, д. Уядыбаш G G C A T T T C C G
Пермский край
Красновишерский, д. Поршакова A G C A T T T C C G
Нытвенский, д. Нытва G G C A T T T C A* G
Красновишерский, д. Поршакова G G C A T С С C A* C**
Экзон 5 Экзон 6 Экзон 7
Образцы
сайты замен
4554 4555 4800 4812 5229 5608 5677 5680 5692 5878 5935
Reference sequence Vg GenBank A T G A G T T C C T T
Башкортостан
Белорецкий, д. Кагарманово A T A A G T T T T T T
Белорецкий, с. Кага A T G A A*** - C T T T C
Белорецкий, с. Серменево A T G G A*** C C T T T C
Бурзянский, д. Галиакберово A T A A A*** C C T T C T
Бурзянский, д. Яумбаево G C G A A*** C C T T C T
Бурзянский, д. Иргизлы A T A A G C C T T T C
Татышлинский, д. Кустаревка A T G A A^A* * * C C T T C T
Татышлинский, д. Сабанчи A T G G A*** C T C C T C
Татышл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.