МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 530-539
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.841.[11+92].012.4
НОВЫЕ ТЕРМОФИЛЬНЫЕ МЕТАНОТРОФЫ РОДА МЕТИУЮСЛЬБиИ
© 2004 г. Б. Ц. Ешинимаев*,**, К. А. Медведкова*,**, В. Н. Хмеленина*, Н. Е. Сузина*, Г. А. Осипов***, А. М. Лысенко****, Ю. А Троценко*1
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Пущинский государственный университет ***Академическая группа академика РАМН Ю.Ф. Исакова, Москва ****Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 23.12.03 г.
Из проб силоса и навоза выделены две чистые культуры облигатных метанотрофов, способных расти в диапазоне температур от 30 до 61°С с максимальной скоростью при 55°С. На основании анализа последовательностей генов 16Б рРНК, мембрансвязанной метанмонооксигеназы (мММО) и фено-типических свойств выделенные штаммы Н-11 и О-12 отнесены к роду МвШу1осаМи,т. Выявлены зависимые от температуры культивирования существенные изменения в морфологии, фосфоли-пидном и жирнокислотном составе клеток. Штаммы Н-11 и О-12 ассимилируют углерод метана посредством рибулозомонофосфатного (РМФ), серинового и рибулозобисфосфатного (РБФ) путей. Активность гексулозофосфатсинтазы не зависела от температуры роста бактерий, однако уровни оксипируватредуктазы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы возрастали при выращивании клеток при 55°С по сравнению с клетками, растущими при 37°С, что свидетельствует о важной роли серинового и РБФ путей в термоадаптации исследуемых штаммов. Ассимиляция происходит путем
восстановительного аминирования а-кетоглутарата и через глутаматный цикл. Обсуждается связь физиолого-биохимических особенностей изолятов с их термофильной природой.
Ключевые слова: термофильные и термотолерантные метанотрофы, Мв1Ну1осаШит.
Метанотрофы - группа грамотрицательных бактерий, использующих метан в качестве основного источника углерода и энергии, что определяет их физиолого-биохимическое своеобразие и специфическую роль в занимаемой экологической нише. Метанотрофные сообщества различных экосистем составляют основу мощного бактериального фильтра, снижающего эмиссию метана в атмосферу [1]. Так, в почвенных и пресноводных экотопах метанотрофы потребляют до 80% биологически образуемого метана [2]. В значительно меньшей степени изучены процессы окисления метана в экосистемах, характеризующихся высокими температурами. В частности, в термофильных циано-бактериальных матах гидротерм, где найдена достаточно полная трофическая цепь, завершающаяся водородным и ацетокла-стическим метаногенезом, аэробное потребление метана микробными сообществами не было выявлено [3]. В последнее десятилетие предпринимаются активные попытки выделения и изучения термофильных метанотрофов, но прогресс в данном направлении весьма незначителен [4]. До сих пор наши знания о таксономическом разнообразии термофильных метанотрофов в основном ог-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm.push-chino.ru).
раничиваются родами МегНу1ососсш и МвгНу1оса1-йыт. Наиболее детально изучен МеАу1ососсш capsulatus, который имеет две формы ММО - растворимую (рММО) и связанную с мембранами (мММО) и является основным объектом молеку-лярно-генетических исследований. Представители рода МеЛу1осаШит отличаются от МеАу1ососсш capsulatus отсутствием рММО, а также последовательностью генов 16Б рРНК (8% дивергенции) [5, 6]. Недавно был выделен штамм НВ, условно отнесенный к новому роду "МеЛуШНегтш", растущий в диапазоне температур от 40 до 70°С, с оптимумом 55-62°С, также имеющий только мММО. Следует отметить, что фено- и генотипические свойства бактерий родов "МеЛуШНегтш" и МеЛ-ylocaldum описаны весьма фрагментарно, а эко-физиологическая роль и механизмы адаптации термофильных/толерантных метанотрофов к высокой температуре не исследовались.
Цель данной работы - выделение и характеристика новых культур термофильных метанот-рофных бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение накопительных культур. Образцы силоса и навоза были отобраны вблизи г. Пущино
в сентябре 2001 г. Температура in situ составляла 60°C и 15°C соответственно. Для получения накопительных культур 2 г пробы вносили в колбы объемом 250 или 750 мл, содержащие 50 мл среды "П", и заполняли смесью метана с воздухом (1 : 1) [7]. Колбы инкубировали при 55°C в термостате с периодическим перемешиванием. После заметного помутнения среды или образования бактериальной пленки на поверхности среды 5 мл иноку-лята переносили в свежую среду и инкубировали в присутствии метана при 55°C на роторной качалке Clim-O-Shake (Швейцария) при 100 об/мин. Процесс накопления метанотрофных бактерий при последовательных пересевах контролировали с помощью фазово-контрастной световой микроскопии.
Выделение чистых культур. Для отделения клеток метанотрофных бактерий от более мелких сопутствующих гетеротрофов суспензии накопительных культур фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0.6-1 мкм ("Millipore", Франция). Фильтры, обогащенные клетками метанотрофных бактерий, помещали в небольшой объем свежей среды и инкубировали в атмосфере метана в течение 5-7 сут. Чистые культуры выделяли методом разведений и истощающего посева на агаризованной средой "П" с добавлением культуральной жидкости накопительной культуры. Видимые колонии метанотоф-ных бактерий вырастали через 1-2 нед. Изолированные колонии пересевали на свежие агаризован-ные среды. Чистоту метанотрофных культур контролировали по отсутствию роста на органических средах, а также с помощью световой и электронной микроскопии.
Электронная микроскопия. Фиксацию клеток, приготовление ультратонких срезов с помощью ультрамикротома Reichert ULTRACUT System (Австрия) и их анализ на электронном микроскопе Jeol JEM 100B (Япония) проводили, как описано ранее [8, 9].
Физиолого-биохимические исследования. Потенциальную активность потребления метана в образцах силоса и навоза определяли радиоизотопным методом при температуре 55°C, как описано ранее [10]. Для оптимизации минерального состава среды, измеряли скорость роста чистых культур метанотрофов в среде "П", разбавленной или в сконцентрированной по минеральным компонентам в два или четыре раза среде "П". В дальнейшем для культивирования выделенных штаммов использовали среду "2П", концентрация всех солей в которой в два раза выше, чем в среде "П". Влияние температуры, концентрации соли и рН среды на рост чистых культур изучали, выращивая бактерии в атмосфере метана и воздуха (1 : 1) в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды "2П". Влияние соли на рост бактерий изу-
чали, добавляя NaCI в концентрациях 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 и 4.0% (в/о). Соответствующие значения рН среды устанавливали внесением фосфатного (рН 5.5 - 8.5) и Na-карбонатного (рН 9 - 10) буферов, до конечной концентрации 50 мМ. Диапазон и оптимальные температуры роста бактерий определяли, выращивая культуры в термостатированной качалке Clim-O-Shake (Швейцария).
Способность изолятов использовать различные углеродные субстраты проверяли, инкубируя культуры на агаризованной среде при оптимальных значениях солености и рН в присутствии метанола, формальдегида, формиата глюкозы, ацетата, цитрата, малата, сукцината, пирувата или сахарозы в концентрации 0.01%. Рост бактерий на различных соединениях азота определяли, заменяя KNO3 мочевиной, дрожжевым экстрактом, (NH4)2SO4 или NaNO2 в концентрации 0.1%. Способность штаммов расти автотрофно в атмосфере Н2 и С02 определяли по описанному методу [11].
Получение экстрактов клеток и определение активности ферментов проводили по известным методам [12]. Спектрофотометрические измерения проводили на регистрирующих спектрофотометрах Specord UV VIS (Германия) и Shimadzu UV-160 (Япония) при 37°C. Присутствие рММО выявляли по окислению нафталина клетками [5]. Содержание белка в экстрактах определяли модифицированным методом Лоури [13].
Хемотаксономическая характеристика. Для
анализа жирных кислот лиофильно высушенные клетки (3 мг) обрабатывали в 0.4 мл 1 N хлористого водорода в метаноле при 80°C в течение 3 ч (кислый метанолиз). Образовавшиеся метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные компоненты экстрагировали гексаном, который затем упаривали, а сухой остаток силилировали в 20 мкл БСТФА в течение 15 мин при 80°C и вновь разбавляли гексаном до 100 мкл. 1 мкл смеси вводили в инжектор системы газового хромато-масс-спек-трометра AT-5973B ("Agillent Technologies", США). Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колонку из плавленого кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0.25 мм. Неподвижная фаза - НР-5ms Хьюлетт-Паккард с толщиной слоя 0.2 мкм. Хроматографию проводили в режиме программирования температуры от 120 до 280°C со скоростью 5 град/мин. Температура инжектора и интерфейса - 280°C. Данные обрабатывали с помощью штатных программ прибора. Вещества в хрома-тографических пиках идентифицировали с помощью библиотечных программ с базами данных масс-спектров nbs75k, NIST и wiley275.
Для анализа жирных кислот в системе Шерлок пробу сухой биомассы (5 мг) подвергали кислому метанолизу. Образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры жирных кислот и диметилацета-
Таблица 1. Нуклеотидиые последовательности использованных в работе функциональных праймеров [14]
Праймер Последовательность (5'-3') Ген-мишень Температура отжига, °C
mxaF 1003f GCGGCACCAACTGGGGCTGGT Все метилотрофы 59
mxaF 1561r GGGCAGCATGAAGGGCTCCC Все метилотрофы 59
pmoA 189f GGNGACTGGGACTTCTGG мММО/АМО 56
pmoA 682r GAASGCNGAGAAGAASGC мММО/АМО 56
mmoX 882f GGCTCCAAGTTCAAGGTCGAGC рMMO 55
mmoX 1403r TGGCACTCGTAGCGCTCCGGCTGG рMMO 55
ли экстрагировали гексаном. 2 мкл смеси вводили в автоматическом режиме с помощью пробоотборника Hewlett-Packard 7673A в инжектор газового хроматографа системы Шерлок для идентификации микроорганизмов по профилю жирных кислот (Microbial Identification System, Microbial ID Inc., Newark, Del. USA). Для анализа использовали параметры хроматографии, рекомендованные в инструкции к прибору.
Для анализа фосфолипидов клетки выращивали в присутствии 14С-метана (10 мкмоль, 12 мкКю, В/О "Изо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.