ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 108-111
УДК 541.64:547.455.623
НОВЫЙ АНТИПРОТЕИНАЗНЫЙ ГЕМОСОРБЕНТ
© 2014 г. Т. А. Валуева*, И. Л. Валуев**, Л. В. Ванчугова**, Л. И. Валуев**
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 **Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН, Москва, 119991 Поступила в редакцию 20.06.2013 г.
Разработан способ получения гидрогелевого биоспецифического гемосорбента путем радикальной сополимеризации ненасыщенного производного овомукоида из белка утиных яиц с акриламидом и К,№-метиленбисакриламидом в водном растворе в присутствии передатчика цепи — меркаптоук-сусной кислоты. Показано, что использование передатчика цепи приводит к изменению структуры образующегося гидрогеля: увеличению степени его набухания в водных растворах и снижению количества пор большого размера. При этом создаются благоприятные условия для функционирования иммобилизованного овомукоида, что приводит к повышению емкости гемосорбента по отношению к сериновым протеиназам.
Б01: 10.7868/80555109914010127
К гемосорбентам — веществам, непосредственно контактирующим с кровью, предъявляются достаточно жесткие требования, главными из которых являются избирательность сорбции, высокая поглощающая способность и гемосовме-стимость. Гемосорбенты не должны сорбировать или травмировать жизненно важные компоненты крови, включая форменные элементы, белки и ферменты, изменять электролитный баланс, компоненты свертывающей системы, артериальное давление и другие медико-биологические показатели. Всем этим требованиям отвечает созданный нами в 90-х годах прошлого века биоспецифический гемосорбент "Овосорб", предназначенный для селективного извлечения из крови активных протеолитических ферментов. Именно поэтому до настоящего времени он находит применение для лечения гнойного перитонита, сепсиса, ожоговой и лучевой болезни, бронхиальной астмы, печеночной и почечной недостаточности и других заболеваний, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментативной интоксикацией [1—4]. Гемосорбент представляет собой поли-акриламидный гидрогель, в котором иммобилизован овомукоид из белка яиц утки — гликопроте-ин с ММ 31000 Да, способный ингибировать се-риновые протеиназы, образовывая с ними неактивные комплексы с константами диссоциации порядка 10-8 М [5]. В последние годы "Ово-сорб" нашел еще одно применение в качестве носителя белковых препаратов, защищающего их от действия пищеварительных ферментов при перо-ральном введении [6—8].
Изучение особенностей применения гемосор-бента в клиниках, наряду с безусловно положи-
тельными клиническими результатами, выявило необходимость решения задачи повышения его емкости. В промышленно выпускаемом гемосор-бенте содержание иммобилизованного овомукоида составляет 7—8 мг/г сорбента, а его емкость по ферментам находится в области 2 мг/г сорбента, что существенно ниже теоретического значения, поскольку одна молекула ингибитора способна взаимодействовать с двумя молекулами трипсина и одной молекулой а-химотрипсина.
Цель работы — получение гемосорбента с повышенной емкостью путем создания благоприятной структуры гидрогеля, формируемого в присутствии овомукоида.
МЕТОДИКА
В работе использовали акриламид, ^№-мети-ленбисакриламид (БИС), персульфат аммония, N,N,N'' ,N'' -тетраметилэтил ендиамин, меркапто -уксусная кислота (МУК) фирмы "Serva" (Германия), инсулин (ММ 6500 Да), сывороточный альбумин человека (САЧ) (ММ 67000 Да), алкогольде-гидрогеназа из дрожжей (АДГ) (ММ 141000 Да), а-химотрипсин (КФ 3.4.21.1) фирмы "Sigma" (США). Овомукоид выделяли из белка яиц утки по методике [1].
Для получения ненасыщенного производного овомукоида (НПОМ) 100 мг овомукоида растворяли в 20 мл 0.5 М бикарбоната аммония, рН 8.0, раствор охлаждали до 0—5°С, добавляли 0.01 мл хлорангидрида акриловой кислоты и смесь перемешивали в течение 15 мин.
Гемосорбент синтезировали путем радикальной полимеризации при комнатной температуре
водного раствора НПОМ, акриламида и БИС. Реакцию полимеризации проводили под действием генерирующей свободные радикалы окислительно-восстановительной каталитической системы: персульфат аммония — М,М,№,№-тетраметил-этилендиамин, в присутствии МУК. Образующийся гидрогель измельчали с помощью механического пресса через сито с диаметром пор 1 мм и промывали 0.5 М бикарбонатом аммония, рН 8.0, до полного удаления непрореагировавших соединений.
Количество иммобилизованного в гидрогеле овомукоида определяли по разнице между исходной концентрацией овомукоида и его концентрацией в промывных водах.
Степень набухания гидрогелей оценивали гравиметрически и рассчитывали по формуле: Sr = = m1/m2 — 1, где m1 и m2 — массы равновесно набухшего и лиофильно высушенного гидрогеля соответственно.
Для изучения проницаемости пор гемосорбен-та для белков с различной молекулярной массой к 2 мл геля, набухшего в 0.5 М бикарбонате аммония, рН 8.0, добавляли 4 мл раствора (2.0 мг/мл) инсулина, САЧ или АДГ в том же буфере. Смесь оставляли при 4° С до установления постоянного значения оптической плотности раствора белка при 280 нм (обычно не более 48 ч). Концентрацию белка в исходном растворе и в растворе после инкубации с гемосорбентом оценивали с использованием калибровочной зависимости, построенной для каждого из указанных выше белков. Учитывая соотношения объемов используемых фаз, рассчитывали количество пор, доступных для белка, принимая за 100% количество пор, доступных для воды.
Для определения емкости гемосорбент помещали в колонку (2.0 х 8.0 см) и на него наносили водный раствор 2.0 мг а-химотрипсина в 1 мл 0.1 М трис-HCl буфера, рН 7.4, или раствор а-химот-рипсина в плазме крови человека, до полного насыщения гемосорбента. Количество связавшегося фермента определяли спектрофотометриче-ским методом при 280 нм после удаления с сорбента 0.1 М HCl, рН 1.0.
Электрономикроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JSM-35, ("Jeol", Япония). Образцы были лиофильно высушены.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гемосорбент получали совместной полимеризацией НПОМ, акриламида и БИС в водном растворе под действием окислительно-восстановительной каталитической системы. Процесс получения гемосорбента включал две стадии. Сначала под действием радикальных инициаторов в рас-
Электронномикроскопические фотографии гемосор-бентов, полученных в отсутствие (а) и в присутствии МУК (б).
творе образовывались линейные растворимые сополимеры НПОМ, акриламида и БИС, которые затем сшивались с образованием гидрогеля. В работе [9] было обнаружено, что проведение реакции радикальной сополимеризации гидрофильного мономера и бифункционального сшивающего агента в условиях, ограничивающих рост образующегося на первой стадии процесса водорастворимого сополимера, позволяет уменьшить содержание в гидрогеле обычно малоэффективных пор большого размера. Этот эффект достигался введением в реакцию МУК — передатчика цепи, ограничивающего рост цепи на первой стадии процесса. Необходимо было выяснить, в какой степени распределение пор по размерам в гидрогеле определяет емкость синтезируемого ге-мосорбента.
Результаты определения зависимости некоторых свойств гемосорбента от условий его получе-
110 ВАЛУЕВА и др.
Зависимость некоторых свойств гемосорбента от условий его получения. Концентрация акриламида в исходном растворе равна 9.0%, концентрация БИС — 0.9%
Исходная смесь, моль/л геля ± 0.5 Доступность пор гемосорбента для молекул, ± 4 % Емкость гемосорбента, мг а- хи-мотрипсина/мг ОМ ± 0.03
[НПОМ] х 104 [МУК] х 103 Инсулин САЧ АДГ
0.3 - 10.7 81 70 47 0.57*
1.2 - 11.4 84 66 44 0.35**
2.5 - 11.9 87 72 40 0.52*
0.3 2.9 14.8 76 73 31 0.68*
1.2 2.9 17.5 84 70 30 0.51**
2.5 2.9 21.7 81 65 26 0.70*
0.3 5.8 18.1 82 65 24 0.65*
1.2 5.8 20.3 84 74 21 0.57**
2.5 5.8 23.6 82 71 20 0.72*
0.3 12 26.3 90 63 26 0.73*
1.2 12 29.7 85 70 20 0.60**
2.5 12 32.2 86 73 20 0.77*
* Сорбция из водного раствора. ** Сорбция из плазмы крови человека.
ния суммированы в таблице. Видно, что, во-первых, проведение реакции в присутствии МУК способствовало увеличению степени набухания гидрогелей примерно в три раза. Во-вторых, при этом количество пор, проницаемых для белков с ММ 6500 и 67000 Да, существенно не изменялось и оставалось на уровне 80 и 70% соответственно, в то время как количество больших пор, доступных для молекул белков с ММ 141000 Да, снижалось более, чем в 2 раза. Эти эффекты, скорее всего, обусловлены особенностями сшивания растворимых сополимеров акриламида и НПОМ, при которых звенья НПОМ концентрировались на поверхности пор и препятствовали образованию толстых стенок, разделяющих поры гидрогеля. Различия в строении гидрогелей видны на электронномикроскопических фотографиях, которые отчетливо показывают уменьшение пор большого размера в геле при проведении полимеризации в присутствии МУК.
Особенность такого строения гидрогеля (большое количество мелких пор с тонкими стенками), вероятно, и явилось причиной повышенной емкости гемосорбента в расчете на количество содержащегося в нем овомукоида. Как уже отмеча-
лось, одна молекула ингибитора с ММ 31000 Да способна связать 1 молекулу а-химотрипсина с ММ 25 000 Да, то есть 1 мг иммобилизованного овомукоида максимально может связать 0.81 мг фермента. Для сорбентов, полученных в отсутствие МУК, ингибитор связывал 0.50—0.57 мг фермента, то есть около 30% иммобилизованного ингибитора были стерически недоступны для молекул фермента и, вероятно, локализованы в разделяющих поры стенках полимера. Использование передатчика цепи, то есть уменьшение толщины стенок (увеличение степени набухания), а также снижение доли малоэффективных пор большого размера увеличивало число удачно иммобилизованных молекул овомукоида, что приводило к возрастанию его измеряемой активности, которая может приближаться к максимально возможному значению (таблица).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование передатчика цепи в процессе получения гемосорбента позволяет регулировать его структуру, создавая наиболее благоприятные условия для проявления иммоби
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.