БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ¡995, том 21, №4, с. 243 - 248
УДК 577.112.5
НОВЫЙ ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ КЛЕТОК ЛИНИИ НЬ-60, ОБРАБОТАННЫХ РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТОЙ. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
© 1995 г, И. А. Костанян, М. В. Астапова, Е. В. Старовойтова, С. М. Драницына, В. М. Липкин*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 07.07.94 г.
Из культуральной среды промиелоцитарной лейкемической клеточной линии НЬ-60 выделен новый белковый фактор с молекулярной массой 8.2 кДа, обладающий дифференцирующей активностью по отношению к исходной клеточной линии. Путем параллельного анализа аминокислотной последовательности белка и нуклеотидной последовательности соответствующей кДНК определена первичная структура фактора. Молекула фактора дифференцировки, секретируемого клетками линии НЬ-60, содержит 54 аминокислотных остатка и гликозилирована.
Ключевые слова: НЬ-60, фактор дифференцировки, ретиноевая кислота.
Поиск новых белковых факторов, останавливающих злокачественный рост опухолевых клеток и вызывающих их дифференцировку, - одна из важнейших задач современной биоорганичес-=-:ой химии. Промиелоцитарная лейкемическая клеточная линия НЬ-60, полученная из крови больного острым лейкозом, является удобной моделью для изучения процессов дифференцировки. В зависимости от используемого индуктора эти клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток миелоидного ряда, теряя при этом способность к неограниченному росту. Такие агенты, как диметилсульфоксид [1,2], ретиноевая кислота [3-5], вызывают дифференцировку клеток линии НЬ-60 в гранулоциты, а витамин Д3 [6,7] и форболовые эфиры [8, 9] - в моноцит/макро-фагподобные клетки.
Ранее было показано, что в ходе дифференцировки клеток НЬ-60 под воздействием ретиноевой кислоты в среде культивирования наряду с известными цитокинами, такими, как фактор некроза опухоли [10] и различные интерлейкины [11, 12], накапливаются не изученные до сих пор пептидно-белковые факторы, обладающие способностью вызывать дифференцировку исходной клеточной линии НЬ-60 по гранулоцитарному пути [13].
Нами был выделен и охарактеризован новый фактор дифференцировки с молекулярной массой 8.2 кДа.
Принятые сокращения: ЫВТ - нитроголубой тетразолий, вбБ - додецилсульфат натрия.
* Автор для переписки.
Для облегчения выделения этого белкового фактора клетки НЬ-60 были адаптированы к росту на бессывороточной среде. Было установлено, что дифференцирующий эффект ретиноевой кислоты одинаков как для адаптированных клеток НЬ-60, так и для клеток, культивируемых в среде с 10% эмбриональной сывороткой теленка.
К среде культивирования адаптированных клеток НЬ-60, обработанных ретиноевой кислотой, добавляли сульфат аммония до 70% насыщения при 4°С (рН 7.0). Осажденный материал разделяли с помощью гель-фильтрации на колонке Тоуореаг1 Н\¥55; в результате получено 5 фракций, обладающих дифференцирующей активностью (рис. 1).
Рис. 1. Гель-фильтрация на колонке Тоуореаг1 Н\¥55: 1 - поглощение при длине волны 280 нм, 2 - дифференцирующая активность.
»280
[NaCl], М
мл
Рис. 2. Ионообменная хроматография на колонке Mono Q фракции I рис. 1:7- поглощение при длине волны 280 нм, 2 - дифференцирующая активность.
Ш
■ 17
■ 14
■8.2 6.3
Рис. 3. SDS-электрофорез фракции, обладающей максимальной дифференцирующей активностью после ионообменной хроматографии на колонке Mono Q (отмечена на рис. 2) (7), и препаратов, содержащих низкомолекулярные белковые стандарты (2, 5). Цифры справа означают молекулярную массу (кДа).
Фракцию I, имеющую максимальную удельную активность, диализовали и подвергали ионообменной хроматографии на анионообменнике Mono Q при рН 9.2 в градиенте концентрации хлористого натрия (рис. 2). Дифференцирующая активность обнаруживалась в элюате при концентрации NaCl, равной 0.05 М, Электрофорети-
ческий и N-концевой аминокислотный анализы полученной фракции показали, что она содержит электрофоретически индивидуальный белок с молекулярной массой 8.2 кДа (рис. 3). Для подтверждения того, что этот белок является новым фактором дифференцировки, участок геля, содержащий белок с М 8.2 кДа, вырезали и белок экстрагировали буфером, содержащим 1% SDS и 0.15 М NaCl. После удаления детергента диализом полученную фракцию стерилизовали и проверяли на дифференцирующую активность с помощью NBT-теста [14]. В табл. 1 представлены выход и удельная активность фактора дифференцировки на разных стадиях выделения. Дифференцирующая активность исследуемого белка соотносилась со способностью снижать общий уровень пролиферации, определяемой по включению в клетки [3Н]тимидина [15] (табл. 2).
Для определения N-концевой последовательности белка был проведен электрофорез в П ААГ в присутствии SDS и белковую зону с молекулярной массой 8.2 кДа переносили на поливинилен-дифторидную мембрану (иммобилон) с последующим анализом иммобилизованного белка на твердофазном секвенаторе (Applied Biosystems, США). При этом удалось определить последовательность девяти N-концевых аминокислотных остатков: Ala-Gly-Ile-Met-Ala-Ser-Leu-Leu-Lys-.
Чтобы получить дополнительную информацию о структуре молекулы фактора дифференцировки, были предприняты попытки расщепить ее с помощью трипсина, химотрипсина и лизилэн-допептидазы. Однако молекула этого белка оказалась устойчивой к действию протеолитических ферментов в стандартных условиях. По-видимому, этот факт связан со значительной степенью гликозилирования данного белка. Действительно, с помощью углеводного анализа было показано, что исследуемый белок - гликопротеин, однако вследствие малого количества доступного материала полный углеводный состав белка определить пока не удалось.
Для определения полной первичной структуры белка был применен генно-инженерный подход.
Таблица 1. Выход и удельная активность фактора дифференцировки на разных стадиях выделения
Стадия выделения Белок, мг Полная активность, ед. акт. Выход, % Удельная активность, ед. акт./мг Степень очистки
Культуральная среда 600 300 100 0.5 1
Высаливание сульфатом 200 150 50 0.75 1.5
аммония
Хроматография, Тоуо- 0.5 75 10 150 300
pearl HW55
Хроматография, Mono Q 0.024 4.8 0.6 2000 4000
НОВЫЙ ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
245
Исходя из структуры 1Ч-концевого пептида были синтезированы следующие олигодезокси-рибонуклеотидные зонды*:
(5') GCC GGA АТС ATG GCC AG (I)
(5') GCT GG^? ATT ATG GC£ AG (H)
(5') ст£ GCC ATG AT y CCG GC (HI)
При выведении нуклеотидной последовательности зондов учитывали частоту встречаемости кодонов в известных на сегодняшний день структурных генах белков человека, а также применяли подход, основанный на гипотезе неоднозначного соответствия [16].
Была создана клонотека кДНК дифференцированных клеток линии HL-60. В качестве затравки при синтезе кДНК использовали статистическую смесь гексадезоксирибонуклеотидов.
Синтезированную кДНК клонировали в плаз-мидный вектор pSp65 по сайту рестриктазы Smal. Полученная клонотека кДНК представительностью 3 х 105 рекомбинантов скринировалась 32Р-мечеными синтезированными зондами.
В результате скрининга было найдено пять клонов, давших положительный сигнал гибридизации. Два из них (Н7 и Е8) использовали для определения нуклеотидных последовательностей клонированных вставок (рис. 4).
Результаты определения нуклеотидной последовательности показали, что клон Н7 содержал полноразмерную кДНК изучаемого белка, включающую 5-нетранслируемую область, кодирующую часть и следующую за ней З'-нетранслируе-мую область. Клон Е8 включал фрагмент кодирующей области нуклеотидной последовательности длиной 94 п. о. и часть З'-нетранслируемой области (78 п. о.).
На рис. 5 представлена нуклеотидная последовательность кДНК белка дифференцировки с M 8.2 кДа (регистрационный номер EMBL-банка данных Х79563). Фрагмент этой последовательности (190 - 216) кодирует структуру N-концевого пептида. В области, предшествующей этому фрагменту, находятся два триплета ATG: один в положении 61 - 63 - это первый ATG-кодон, следующий после нонсенс-кодона TAG (16 -18), в той же рамке считывания, что и полипептидная цепь белка, другой - в положении 158 - 160. Каждый из этих триплетов может выполнять роль инициирующего кодона. Для точки инициации трансляции предпочтительно некоторое специфическое окружение: наличие пурина в положении -3, G в положениях -6 и -9, а также А и С в позициях -1, —2, -4, -5 [17 - 19]. Кроме того, показано, что инициация трансляции преимущественно проис-
* Префикс "d" опущен.
Hinclï Hael Dra\ Нае] Ter Kpnl Ncol
I II I III
I (a)
~ 100 п. o.
I-1
__H7
1(6)
E8_
1(b)
Рис. 4. Рестриктная карта кДНК белка дифференцировки с M 8.2 кДа (а) и стратегия определения нуклеотидной последовательности кДНК клонов Н7 (б) и Е8 (в). Стрелками над фрагментами кДПК показаны направления и протяженность секвенирования. Подчеркнут участок, отвечающий положению нуклеотидных зондов, использованных для скрининга кло-нотеки кДНК.
ходит с первого ATG-кодона, если он удален от начала 5'-концевой области мРНК хотя бы на 12 нуклеотидов. Из двух ATG-кодонов первый имеет окружение, наиболее удовлетворяющее перечисленным особенностям. Можно предположить, что инициация трансляции осуществляется именно с этого кодона. За кодоном ААА (349 - 351), кодирующим остаток Lys, следует терминирующий кодон ТАА (352 - 354). На участках 350 - 355 и 346 - 351 находятся последовательности ААТААА, каждая из которых может быть возможным сайтом полиаденилирования.
N-Концевой аминокислотный остаток алани-на в структуре, выведенной из нуклеотидной последовательности кДНК, удален от, возможно, инициирующего метионина на 42 аминокислоты. Это позволяет сделать предположение, что после синтеза белок подвергается протеолитичес-кому процессингу, аналогично тому, что было описано при изучении человеческого секреторного
Таблица 2. Дифференцирующая активность исследуемого белка в NBT-тесте и способность подавлять пролиферацию, определяемая по включению в клетки [?Н]тимидина
Тестируемое вещество Включение [3Н]
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.