ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 584-591
УДК 577.152:577.113:579.252
НОВЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ С ВЫСОКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПЕНИЦИЛЛОПЕПСИНА НА ОСНОВЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА
Pénicillium canescens
© 2015 г. И. А. Смирнова*, А. С. Середа*, Е. В. Костылева*, Н. В. Цурикова*, Е. В. Бушина**, А. М. Рожкова**, А. П. Синицын**' ***
*Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии, Москва, 111033 **Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 ***Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, 119991
e-mail: Katrintz@mail.ru Поступила в редакцию 08.04.2015 г.
Методами генной инженерии создан штамм — продуцент грибного пенициллопепсина, аспартат-ной протеазы. Изучены биохимические и физико-химические свойства ферментного препарата пенициллопепсина, полученного из культуральной жидкости продуцента. Проведено сравнение свойств нового ферментного препарата и коммерчески доступного аспергиллопепсина. Установлено, что их протеолитическая активность составляла 670—680 ед./г препарата. Показано, что выход растворимого белка при гидролизе пшеничной муки пенициллопепсином в 2.7 раза выше, чем при действии аспергиллопепсина, что, возможно, обусловлено присутствием ксиланазной активности в препарате пенициллопепсина.
Ключевые слова: Pénicillium canescens, аспартатные протеазы, пенициллопепсин, гидролиз пшеничной муки.
DOI: 10.7868/S0555109915060161
Протеолитические ферменты широко используются в большинстве биотехнологических процессов переработки белоксодержащего сырья животного и растительного происхождения. При выборе ферментных препаратов (ФП) необходимо учитывать условия проведения технологических процессов, особенности структуры белковых субстратов и пептидный состав конечных продуктов [1, 2].
Мицелиальные грибы продуцируют ряд про-теолитических ферментов, специфичность действия которых обеспечивает получение продуктов с заданными свойствами [3, 4]. Так, грибные аспартатные протеазы позволяют проводить ограниченный протеолиз широкого спектра белковых субстратов без образования горьких пептидов [5], обеспечивая выход воспроизводимых продуктов, т.е. при одинаковых условиях гидролиза белка образуются одинаковые пептиды [6—9]. Применение аспартатных протеаз в некоторых технологических процессах обусловлено их высокой активностью при низких значениях рН 3—5 [1].
Группа аспартатных протеаз представлена пепсиноподобными протеазами, продуцируемыми грибами родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus и др. [8, 10, 11]. Из пепсинов микробного происхождения в промышленности применяются, главным образом, аспергиллопепсин I
(КФ 3.4.23.18) и пенициллопепсин (КФ 3.4.23.20), обладающие наиболее широкой субстратной специфичностью и аналогичными биохимическими и физико-химическими свойствами [http://www.brenda-enzymes.org, 12].
Аспартатные протеазы применяются для получения белковых гидролизатов без горечи и вкусовых добавок, для изменения органолептических показателей в молочном производстве, получения широкого ассортимента соевых продуктов с высоким содержанием белка, в том числе соевых соусов [3, 4, 13, 14]. Поскольку такие протеазы не влияют на органолептические свойства напитков и процесс пенообразования, то успешно используются в виноделии и пивоварении [1, 15]. В спиртовом производстве добавление кислых протеаз в сусло на стадии брожения позволяет эффективно гидролизовать белок и разрушать структурные связи в белково-липидных оболочках зернового сырья, что повышает эффективность действия глю-коамилазы и увеличивает степень конверсии углеводов, увеличивая конечный выход спирта [16, 17]. Применение кислых грибных протеаз позволяет проводить ограниченную протеолитическую модификацию пшеничного глютена, что определяет свойства и вкус хлеба, обеспечивает стандартизацию процесса хлебопечения и сокращает техно-
логический цикл [18]. При производстве кормов из целлюлозосодержащих отходов таких, как барда, соевая шелуха, пшеничная солома и др. с использованием ферментов целлюлолитического и гемицеллюлолитического комплекса внесение ас-партатных протеаз увеличивает содержание усвояемых углеводов за счет гидролиза белков растительных клеточных стенок [19].
В настоящее время коммерчески доступны, главным образом, ФП щелочных и нейтральных бактериальных протеаз. Ассортимент грибных протеаз ограничен в связи с их высокой стоимостью, обусловленной низким уровнем активности продуцентов. ФП аспартатных протеаз производят компании "DSM" (Нидерланды), "Amano Pharmaceuticals" (Япония) [13] и "Beijing Challenge Bio-technology Limited Company" (Китай) [http://worldenzyme.com/ index.php?a=show&m=Article&id=336]. Кислая ас-партатная протеаза, аспергиллопепсин I, входит в состав комплексного ФП "Flavourzyme" ("No-vozymes A/S", Дания), содержащего грибные про-теазы/пептидазы [13].
Цель работы — получение высокоактивного ферментного препарата грибной (кислой) аспар-татной протеазы, пенициллопепсина, и изучение его основных биохимических и физико-химических свойств и гидролитической активности, в том числе, при гидролизе зернового сырья.
МЕТОДИКА
Реагенты. В работе использовали реактивы фирм "BioRad" (США), "MP Biomedicals Inc." (Франция) и "Реахим" (Россия), кумасси бриллиантовый синий R-250 ("Ferak", Германия) и
коммерческий ФП кислой грибной протеазы "Acid protease" ("Beijing Challenge Bio-technology Limited Company", Китай), а для определения молекулярной массы в качестве белков-маркеров (14.4-97 кДа и 20-116 кДа) - набор SDS-PAGE Standards, Low Range ("Bio-Rad", США).
Гемоглобин, ксилан из древесины березы фирмы "Sigma" (США), пшеничная мука (ООО "Гарнец", Россия) были использованы в качестве субстратов.
Штаммы микроорганизмов. В качестве реципи-ентного штамма был использован предоставленный ИНБИ им. А.Н. Баха РАН штамм Pénicillium canescens RN3-11-7 niaD(-), дефектный по гену niaD, кодирующему нитратредуктазу [20, 21]. Данный штамм является продуцентом комплекса карбогидраз, содержащего, в основном, гемицел-люлазы (эндо^-1,4-ксиланаза, ксилоглюкан эн-до^-1,4-глюканаза, a-L-арабинофуранозидаза, арабиноксилан-арабинофураногидролаза и a-га-лактозидаза А и С) [21, 22].
Для субклонирования целевых генов, а также для препаративного получения ДНК использовали Escherichia coli штамм Mach-1 (ArecA1398 endA1
tonA Ф80AlacM15 AlacX74 hsdR(rKm +K)) фирмы "In-vitrogen" (США).
Плазмида. В работе использовалась экспресси-онная плазмида pPrXEG_PEP, несущая гомологичный ген пенициллопепсина из P. canescens (pepA) под ксиланазным промотором (xylA). Плазмида pPrXEG_PEP была получена по схеме, включающей амплификацию гена pepA методом ПЦР из геномной ДНК штамма P. canescens с применением олигонуклеотидов:
pepA-UpLIC:caaacagaagcaaccgacacaatggttgtcttcagccagatcacg, pepA-LowLIC:agagcaagccgagcaggttaggcctggggagcgaagccaaga,
и клонирование полученного ПЦР-продукта в вектор pXEGuniversal, обеспечивающий экспрессию целевого гена pepA за счет его стабильной интегра-тивной встройки в хромосому гриба P. canescens. Клонирование гена pepA проводили с использованием метода независимого лигирования, описанного в работе [23].
ПЦР проводили на приборе MyCycler ("BioRad", США) по следующему протоколу: 95°С — 4 мин - 1 цикл; 95°С - 1 мин 30 с, 50°С - 1 мин, 68°С - 2 мин - 25 циклов; 68°С - 10 мин, 4°С -30 мин. Для амплификации гена пенициллопепсина использовалась высокоточная полимераза Pfx ("Invitrogen", США). Для обработки 5' и З'-концов ПЦР-продукта и линеаризованного вектора использовалась T4 полимераза ("Fermentas", Германия). Геномная ДНК штамма P. canescens была выделена с использованием набора "DNeasy Mini
Plant" ("Qiagen", США). Выделение ПЦР-про-дукта, а также его очистку проводили с помощью наборов "QIAquick Gel Extraction" и "QIAquick PCR Purification" ("Qiagen", США).
P. canescens RN3-11-7 niaD(-) был трансформирован по методу, описанному в работе [24].
Среды для культивирования штаммов P. canescens. Штамм хранили в пробирках на скошенной среде в течение 30 сут при 4°С, после пересева выращивание проводили в течение 7 сут. Активность штамма определяли при глубинном культивировании после каждого пересева.
Биомассу исходного штамма-реципиента для трансформации получали с использованием минимальной среды, содержащей (%): KH2PO4 — 0.15, KCl - 0.05, MgSO4 • 7H2O - 0.05, H3BO3 - 0.00025, CuSO4 • 5H2O - 0.002, FeSO4 • 7H2O - 0.004,
586
СМИРНОВА и др.
MnSO4 • 2H2O - 0.004, Na2MoO4 • 2H2O - 0.004, ZnSO4 • 7H2O - 0.004, глюкозу - 1.0, и NH4Cl -10 мМ. Трансформанты высевали на агаризован-ную (2.0 % агара) минимальную среду, в которой 10 мМ NH4Cl был заменен на 10 мМ NaNO3. Споровый посевной материал штаммов получали и хранили на среде следующего состава (%): глюкоза - 1.0, КН2РО4 - 1.0, дрожжевой экстракт - 0.5, агар-агар - 2.0, штамм выращивали не менее 7 сут при 30°С.
Для глубинного культивирования штамма использовали ферментационную среду, следующего состава (%): соевая шелуха - 4.5, кукурузный экстракт - 5.0 и KH2PO4 - 2.5. Культивирование продуцента в лабораторных условиях осуществляли в колбах объемом 750 мл в 100 мл ферментационной среды на качалке (240 об./мин) в течение 144 ч при 30°С. Культуральную жидкость (КЖ) отделяли от мицелия центрифугированием при 10750 g в течение 10 мин.
Ферментные препараты. Сухой ФП пеницилло-пепсина был получен из КЖ рекомбинантного штамма-продуцента. Культивирование проводили в ИБФМ РАН (Пущино) в ферментере объемом 10 л на ферментационной среде в течение 144 ч. В качестве пеногасителя перед стерилизацией вносили лапрол (0.1%). Температура культивирования составляла 28 ± 0.2°C, рН 4.0-4.2 в начале ферментации и 6.0-6.3 в конце. После отделения биомассы гриба-продуцента КЖ концентрировали на ультрафильтрационной установке с порогом отсечения 15 кДа. Ультраконцентрат высушивали на установке с псевдоожиженным слоем "MIDI-GLATT" ("Glatt Ingenieurtechnik GmbH Weimar", Германия). Для приготовления ФП использовали в качестве носителя пшеничные отруби. Температура на входе составляла 70-80°C, скорость подачи воздуха от 12 до 17 м3/ч, скорость пода
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.