БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 2, с. 248-252
= ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 547.392.52.057
НОВЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛОГ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРАНСПОРТА АНАНДАМИДА В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ
© 2014 г. Н. М. Грецкая, М. Г. Акимов, В. В. Безуглов#
ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 12.09.2013 г. Принята к печати 19.09.2013 г.
Впервые синтезирован новый флуоресцентный аналог анандамида, содержащий ВОВ1РУ®-РЬ-флуорофор, присоединенный к арахидоновой кислоте через 2,2'-(этилендиокси)-бис(этилендиа-мин). На клетках глиомы С6 крысы показано, что флуоресцентный аналог является субстратом клеточной системы захвата анандамида (Кт 4.5 ± 0.9 мкМ, Ртах 20 ± 1 амоль/(мин х клетка)).
Ключевые слова: анандамид, глиома С6 крысы, транспорт амидов жирных кислот, ВОВ1РУ®-¥Ь-С3-кислота.
БОТ: 10.7868/80132342314020043
ВВЕДЕНИЕ
Анандамид (этаноламид арахидоновой кислоты, АЕА (I) — эндогенный сигнальный липид семейства эндоканнабиноидов. Он является специфическим агонистом каннабиноидного рецептора СВ1 и участвует в процессах памяти, контроля размножения, потребления пищи, развития нервной системы и двигательной активности [1]. Сигнальное действие АЕА прекращается под действием специфических гидролаз, например, мем-браносвязанной гидролазы амидов жирных кислот первого типа (ЕААИ-1) [2]. Несмотря на то что АЕА может свободно проникать в биологические мембраны, эксперименты с использованием специфических блокаторов транспорта (например, ^-(4-гидроксифенил)арахидоноиламида, АМ404 (II) [3]) позволили высказать предположение о существовании селективной системы транспорта анандамида через клеточную мембрану. Согласно современным представлениям, основным механизмом захвата клетками АЕА является облегченная диффузия с участием специфического переносчика [4, 5] с Кт 41 ± 15 мкМ и Ртзх 0.61 ± ±0.04 нМ/мин/106 клеток для нейронов [6]. Транспортер АЕА до сих пор не идентифицирован, а в пользу его существования говорят только косвенные данные: захват анандамида является
Сокращения: АЕА — этаноламид арахидоновой кислоты, ВОБ1РУ® -БЬ-Сз — 4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бор-3а,4а-диаза-8-индацен-3-пропионовая кислота, РААИ-1 — гидролаза амидов жирных кислот первого типа, ЕВВЕ — 2,2'-(этилендиокси)-бис(этилендиамин).
# Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-65-92; эл. почта: vvbez@ibch.ru).
селективным, насыщаемым процессом, зависящим от температуры [7].
В последнее время предложено несколько кандидатов на роль белка-переносчика АЕА. Одним из них может быть сплайс-вариант БААИ-1, который сохранил способность связывать АЕА, но утратил способность катализировать гидролиз анандамида. Его активность блокируют специфические ингибиторы транспорта АЕА (например, АМ404). Этот белок лучше растворим в воде по сравнению с БААИ-1 за счет образования им гомодимеров, а повышение его экспрессии увеличивает накопление анандамида в клетках [8]. Также было показано, что определенный вклад в транспорт АЕА могут вносить альбумин, белок теплового шока 70 (ЖР70) и белки, связывающие жирные кислоты (БАВР5 и ЕАВР7) [9], которые, однако, не могут рассматриваться как специфические белки-транспортеры. По-видимому, в процессе внутриклеточного транспорта ананда-мида участвует несколько систем, которые в различной степени используются разными клетками [7], однако механизмы, по которым АЕА транспортируется в меж- и внутриклеточном пространстве и переносится через мембраны, остаются предметом дальнейшего изучения.
Несмотря на теоретическую привлекательность флуоресцентных аналогов АЕА в качестве инструментов для изучения транспорта ананда-мида, в литературе имеется мало работ, посвященных их созданию.
Так, флуоресцентный аналог АЕА, представляющий собой конъюгат (карбаматное производное) АЕА и диацетата флуоресцеина (8КМ 4-45-1
НОВЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛОГ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРАНСПОРТА 249
HO'
о о
(I) HO (II)
vyyYYV
о K^K Л^ о
HN
O^ .N. /ч
O
HO
H
R O
(III)
(IV)
(V), R
(VI), R = H
Формулы.
(III)), пригодный для изучения транспорта AEA через мембраны, был предложен группой Хил-лард [10]. Это соединение (III) ингибирует захват [3H]AEA гранулярными клетками головного мозга (IC50 7.8 ± 1.3 мкM). С другой стороны, сам анан-дамид и специфические ингибиторы его транспорта ингибируют захват SKM 4-45-1 (в клетках глиомы С6 IC50 6.1 и 53.8 мкМ для AM404 и анандамида соответственно). Эти свойства позволяют рассматривать данный аналог как альтернативный субстрат транспортера анандамида. Однако SKM 4-45-1 флуоресцирует только после воздействия на него внутриклеточных эстераз, и из работы [12] не вполне понятно, отвечает ли его сигнал стационарному состоянию или нет. Этот факт ограничивает пригодность SKM 4-45-1 для анализа кинетики транспорта.
Был синтезирован альтернативный аналог AEA, в котором к окисленному С-концу молеку-
лы через простую эфирную связь был присоединен 2-трет-бутил-2-метил-1,3-бензодиоксол-4-карбоксилат (IV) [11]. Хотя данное соединение и обладало, подобно анандамиду, ангиогенными свойствами, его аффинность к каннабиноидным рецепторам СВ1 и СВ2 была меньше в 100 раз, а его пригодность для анализа транспорта не проверялась.
В настоящей работе решена задача синтеза флуоресцентного аналога AEA, который может быть использован для изучения транспорта анан-дамида в клеточных культурах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Нами предложен новый флуоресцентный аналог анандамида (V), в котором этаноламидная часть молекулы заменена 2,2'-(этилендиокси)-бис(этилендиамином) (EDBE), ацилированным
250
ГРЕЦКАЯ и др.
амоль/(мин х клетка) 25 г
20
15 -
10 -
60 мкМ
Рис. 1. Зависимость скорости захвата клетками глиомы С6 соединения (V) от его концентрации: (1) только соединение (V), (2) соединение (V) + 100 мкМ ингибитор АМ-404 (среднее ± стандартное отклонение).
фмоль/(мин х клетка) 2.0
• 1 • 2
200 мин
Рис. 2. Зависимость накопления соединения (V) клетками глиомы С6 от времени при температуре 37 (1) и 4° С (2) (среднее ± стандартное отклонение).
флуоресцентной BODIPY^-FL-пропионовой кислотой. Такой же линкер был ранее использован Маккарроне и соавт. для синтеза биотинилирован-ного анандамида, который, как показано авторами, оказался пригодным для изучения накопления и распределения анандамида в линии кератиноци-тов HaCaT [12].
Арахидоновую кислоту после обработки N,N- дисукцинимидилкарбонатом конденсировали с EDBE. Полученный амид (VI) далее ацили-ровали пентафторфениловым эфиром флуоресцентной BODIPY^FL-пропионовой кислоты и
выделяли целевое соединение (V) хроматографией на силикагеле.
Для синтезированного соединения (V) были получены спектры поглощения и испускания в области, характерной для исходного BODIPY®-FL [13], в той среде, в которой планировалось проводить эксперименты с культурой клеток. Найдено, что основной максимум поглощения соединения (V) находится при длине волны 508 нм, а максимум испускания — при 535 нм (^возб 508 нм); эти значения были использованы при исследовании транспорта флуоресцентного аналога (V) в клетки глиомы линии С6 крысы.
Установлено, что эти клетки накапливают соединение (V); данный процесс зависел от концентрации вещества (рис. 1), времени инкубации и температуры (рис. 2). Кинетические параметры захвата (Km 4.5 ± 0.9 мкМ, Vmax 20 ±1 амоль/(мин х х клетка)) практически не отличаются от таковых для анандамида на линии ретинобластомы RBL-2H3, приведенных в работе Моора (Km 4.69 ± ± 0.460 мкМ, Vmax 21.5 амоль/(мин х клетка)) [14], и близки к значениям, полученным на клетках С6 (Km 0.7—7 мкМ, Vmax 3.9 амоль/(мин х клетка) [15, 16]). Известный специфический ингибитор транспорта анандамида, AM-404 (IC50 14.9 мкМ [18]), действует и в отношении полученного нами флуоресцентного аналога, причем по механизму конкурентного ингибирования: в присутствии ингибитора Km 16 ± 3 мкМ, Vmax 22 ± 2 амоль/(мин х клетка) (не отличается от Vmax без ингибитора; критерий Акаикэ). Снижение температуры до +4°C замедляет накопление соединения (V) только на 24%, что, совместно с приведенными выше данными, согласуется с механизмом облегченной диффузии [10].
Следует отметить, что при длительной инкубации (24 ч) в клетках, находившихся при 37°С, но не при +4°C, наблюдается снижение флуоресценции, что может быть следствием деградации производного (V) или его гидролиза с последующим выбросом фрагмента BODIPY в инкубационную среду.
Таким образом, в настоящей работе синтезирован новый флуоресцентный аналог анандамида на основе флуорофора BODIPY®-FL. Показано, что данное соединение распознается клеточной транспортной системой анандамида, причем кинетические параметры процесса практически не отличаются от таковых для естественного субстрата.
Работа частично поддержана грантами РФФИ № 12-04-00608а и программы Президиума РАН "Фундаментальные науки — медицине". Авторы выражают благодарность фирме ООО "Текан" (Москва, Россия) за предоставление во времен-
НОВЫЙ ФЛУОPЕCЦЕНTНЫЙ AНAЛОГ ДЛЯ ИCCЛЕДОВAНИЯ TPAНCПОPTA
251
ное пользование планшетного анализатора Infinite M200Pro.
ЭКCПЕPИМЕНTAЛЬНAЯ 4ACTb
В работе использовали арахидоновую кислоту (95% чистоты, Россия), изобутилхлорформиат (Flu-ka, Швейцария), триэтиламин (Merck, Германия), 2,2'-(этилендиокси)-бис(этилендиамин) (EDBE), N,N"-дисукцинимидил карбонат (Aldrich, Германия), 4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бор-3а,4а-диаза^-индацен-3 пропионовая кислота (BODIPY®-FL-C3) (Molecular Probes, CШA), бис(пентафторфенил)-карбонат (любезно предоставлен A.И. Мирошни-ковым, ИБХ PAН), арахидоноил-пара-аминофе-нол (AM-404, синтезировали по методу [17] (№-ЯМР (CDCl3; м.д., J, Гц) 0.891 (3 Н, т, Н20), 1.286-1.352 (6Н, м, Н17, Н18, Н19), 1.771 (2 Н, квинт., Н3), 2.028-2.04 и 2.126-2.137 (4 Н, д.кварт., Н4, Н16), 2.281 (2 Н, т., Н2,) 2.782 (6 Н, квинт., Н7,Н10, Н13), 5.297-5.366 (8 Н, м, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н12, Н14, Н15), 6.623-6.638 (2Н, д, J 6.6, H3', H5'), 6.976 (1 Н, с, NH), 7.105-7.120 (2 H, д, J7.1, H2', H4').
Растворители очищали по стандартным методикам [18]. Тетрагидрофуран (THF) очищали перегонкой над натрием в присутствии б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.