МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 1, с. 117-123
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2.616-006
НОВЫЙ ФОРМАТ ИММУНО-ПЦР ДЛЯ СЫВОРОТОЧНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ
© 2014 г. И. Г. Никитина1, Е. Ю. Сабирова1, О. Н. Солопова2, С. А. Суржиков1, Е. Н. Гринева1, В. Л. Карпов1, Н. А. Лисицын1, С. Ф. Берестень1*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Москва, 117638
Поступила в редакцию 29.05 2013 г. Принята к печати 25.06.2013 г.
Описан новый формат иммуно-ПЦР, основанный на детекции мембранного белка CDH17 в составе сывороточных экзосом. Использование формата позволяет различить образцы сыворотки крови здоровых доноров и больных раком толстой кишки. Полученные результаты открывают возможность сывороточной диагностики рака толстой кишки в группах повышенного риска.
Ключевые слова: опухолевые экзосомы, иммуно-ПЦР, ДНК-репортер, гомопраймер, рак толстой кишки.
A NEW IMMUNO-PCR FORMAT FOR SEROLOGICAL DIAGNOSIS OF COLON CANCER, by I. G. Nikitina1, E. Yu. Sabirova1, O. N. Solopova2, S. A. Surzhikov1, E. N. Grineva1, V. L. Karpov1, N. A. Lisitsyn1, S. F. Beresten1* (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 2All-Russia Scientific Center of Molecular Diagnostics and Treatment, Moscow, 117638 Russia; *e-mail: sberesten@gmail.com). A new immuno-PCR format is described that is based on detection of membrane protein CDH17 in serum exosomes. Format application allows distinction between sera samples of healthy donors and colon cancer patients. Obtained results open a possibility of serological colon cancer diagnosis in high risk groups.
Keywords: tumor exosomes, immuno-PCR, DNA reporter, homoprimer, colon cancer. DOI: 10.7868/S0026898413060098
Центральной задачей современной протеомики является количественный анализ изменений в содержании белков биологических образцов в норме и при патологии. Чувствительность существующих методов количественного анализа сильно различается [1]. К среднечувствительным методам относятся масс-спектрометрия, а также большинство стандартных иммунологических тестов (предел чувствительности 10 фмоль/л—1 пмоль/л). Один из наиболее чувствительных тестов — метод иммуно-ПЦР, основанный на взаимодействии конъюгата антитело-ДНК-репортер с анализируемым белком (антигеном) и последующей амплификации ДНК-репортера [2]. Существуют две основные модификации иммуно-ПЦР. Первая предполагает выявление бинарных комплексов антиген-антитело. В этом случае белки образца иммобилизуют в лунке плашки, инкубируют с конъюга-том ДНК-репортера с детектирующими антите-
лами к анализируемому белку и определяют образовавшиеся комплексы по результатам ПЦР. Более чувствительный альтернативный подход предусматривает образование тройного сэндвич-комплекса захватывающих антител, антигена и конъ-югата детектирующих антител с ДНК-репортером. При этом в лунке иммобилизуют захватывающие антитела, которые инкубируют с белками образца, а затем с конъюгатом. Метод иммуно-ПЦР с образованием сэндвич-комплекса позволяет определять в модельных экспериментах разведения чистого белка в концентрации до 10 амоль/л [3].
Поскольку концентрации белков в биологических образцах могут различаться в 1012 раз, чувствительность обнаружения антигена в реальных тестах, как правило, падает в десятки раз по сравнению с модельными экспериментами. Основная причина этого — конкурирующие с основной реакцией антиген-антитело неспецифические взаимодействия
Принятые сокращения: ПЦР — полимеразная цепная реакция; РТК — рак толстой кишки, ПААГ — полиакриламидный гель; SDS — додецилсульфат натрия; PBS — фосфатно-солевой буфер; DTT — дитиотреитол.
* Эл. почта: sberesten@gmail.com
высококопийных белков образца с компонентами тест-системы (фон). Кроме того, чувствительность и специфичность метода ограничивается еще несколькими факторами. Во-первых, проведение им-муно-ПЦР заметно осложняется неспецифической адсорбцией конъюгата к поверхности пробирки или плашки. Во-вторых, чувствительность протокола зависит от степени инактивации антител в процессе конъюгации и эффективности конъюгации ДНК-репортера с антителами. Наконец, в случае небольшого количества молекул анализируемого белка в образце существенную роль играют эффективность и специфичность ПЦР, которые определяют количество ложноотрицательных и ложноположительных результатов.
В данной работе разработан усовершенствованный формат иммуно-ПЦР, позволяющий повысить чувствительность и специфичность метода и заметно упростить проведение процедур. Новый формат был использован для сравнительного анализа содержания белка СЭН17 в составе сывороточных экзосом, т.е. покрытых мембраной микропузырьков, секретируемых в кровь большинством типов клеток, количество которых в кровотоке резко возрастает на поздних стадиях канцерогенеза [4—6]. Использование нового формата позволило надежно различить образцы сыворотки крови здоровых доноров и больных раком толстой кишки.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клонирование и экспрессия фрагментов белка
CDH17. кДНК, кодирующие два фрагмента полипептидной цепи белка CDH17 (аминокислотные остатки 24—132 и 581—678), не имеющих гомологии с другими белками, синтезировали химико-ферментативным способом по стандартному протоколу [7]. После достройки второй цепи кДНК клонировали в экспрессионный вектор pET29b. Правильность нуклеотидных последовательностей вставок подтверждали секвенированием. кДНК, кодирующие фрагменты белка CDH17, экспресси-ровали в штамме Escherichia coli BL21(DE3) по стандартному протоколу. Образовавшиеся тельца включения растворяли в 50 мМ Трис-НС1-буфере (pH 7.5), содержащем 200 мМ NaCl и 8 М мочевину. Лизаты центрифугировали при 12000 g, рекомби-нантные фрагменты белка очищали из супернатан-та на носителе HisTrap™ FF ("GE Healthcare", США) по протоколу компании-производителя. Полученные фрагменты обрабатывали 1%-ным SDS с 100 мМ DTT в течение 5 мин при 100°C и обессоливали на колонке HiTrap™ Desalting Column ("GE Healthcare"), уравновешенной PBS с 0.1% SDS (для последующей иммунизации жи-
вотных) или 0.1 М NaHCO3 с 0.1% SDS (для получения аффинного носителя для очистки антител).
Получение антител к фрагментам белка CDH17.
Иммунизацию овец N-концевым фрагментом белка CDH17 проводила компания "ИМТЕК" (Россия) по стандартному протоколу. Высокоаффинные поликлональные антитела очищали из антисыворотки методом аффинной хроматографии как описано ранее [8]. Для производства мо-ноклональных антител мышей линии BALB/c иммунизировали C-концевым фрагментом белка CDH17 и получали коллекцию гибридом по стандартному протоколу [9]. Клоны, секретирующие антитела к фрагменту белка CDH17, идентифицировали по результатам непрямого иммунофер-ментного анализа культуральных супернатантов и очищали методом предельных разведений. Антитела очищали из асцитных жидкостей на колонке с белок^-сефарозой, а затем проводили гель-фильтрацию препарата на колонке Superdex 200 ("GE Healthcare").
Вестерн-блотинг сывороточных экзосом. Четыре образца сыворотки крови (по 0.5 мл), полученные в НИИ Онкологии СО РАМН от больных раком толстой кишки (стадии Т3 или Т4), и четыре образца сыворотки здоровых доноров (собраны в ИМБ РАН) инкубировали с препаратом ExoQuick ("System Biosciences", США), экзосомы осаждали центрифугированием в соответствии с протоколом компании-производителя. Осадки растворяли в буфере Лэммли для образцов и проводили Ве-стерн-блотинг по стандартному протоколу с использованием коктейля моноклональных антител к C-концевому фрагменту белка CDH17 и конъюгата вторичных антител (rabbit anti-mouse) с пе-роксидазой хрена ("Santa Cruz Biotech", США).
Химический синтез ДНК-репортера и прайме-ров. Для синтеза использовали следующие продукты компании "Glen Research" (США): дезок-сирибофосфорамидиты (dA CE Phosphoramidite, dmf dG CE Phosphoramidite, dT CE Phosphoramidite, Ac dC CE Phosphoramidite), стеклянные шарики с 3'-глицериловым линкером (3'-Glyceryl CPG), 5'-аминомодификатор (5'-Amino-Modifier C6) и 2 М триэтиламмонийацетат. ДНК-репортер JW с З'-глицериловым линкером на З'-конце и 5'-аминомодификатором на 5'-конце (таблица) синтезировали на приборе 394 DNA/RNA synthesizer ("Applied Biosystems"). Продукт очищали на жидкостном хроматографе "Gilson" (Франция) в градиенте ацетонитрила в 0.1 М растворе триэтилам-монийацетата на колонке Hypersil 250 х 4.6 мм ("MZ analytical", Япония). По окончании синтеза на 5'-конец олигонуклеотида присоединяли флуоресцентную метку Cy5 с использованием набора компании "Innova Biosciences" (США). Прайме-
ры RW и RJ и гомопраймер R синтезировали по стандартному протоколу (таблица).
Конъюгация антител и ДНК-репортера с магнитными микрошариками. Магнитные микрошарики с поверхностными гидразидными группами (15 мг, BcMag hydrazide-terminated beads, диаметр 1 мкм) отмывали в соответствии с протоколом компании-производителя ("Bioclone", США) и суспендировали в 600 мкл буфера для связывания. Диольные группы олигосахаридных остатков мо-ноклональных антител к белку CDH17 (100 мкг) окисляли периодатом натрия в течение ночи по протоколу компании и переводили в буфер для конъюгации с использованием колонки HiTrap™ Desalting Column объемом 5 мл ("GE Healthcare"). Полученный препарат концентрировали с использованием системы ультрафильтрации Ultracel 10k ("Millipore") до объема 200 мкл (конечная концентрация антител — 0.35 мкг/мкл). Диольные группы глицерильного остатка ДНК-репортера (10 мкг) окисляли и концентрировали по протоколу обработки антител (конечная концентрация репортера 0.035 мкг/мкл). Препараты окисленных антител и ДНК-репортера объединяли с микрошариками (конечный объем 1 мл) и проводили конъюгацию в течение ночи при комнатной температуре. Микрошарики отмывали 3 раза по 15 мин коммерческим буфером для отмывки по протоколу производителя и суспендировали в 0.5 мл PBS, содержащего 0.1% азида натрия.
Иммуно-ПЦР. Для проведения модельного опыта разведения C-концевого фрагмента белка C
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.