УДК 547.92;572.152;579.873.21
НОВЫЙ ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ
© 2015 г. В. А. Андрюшина*, Н. В. Карпова*, А. В. Дружинина*, Т. С. Стыценко*, Е. А. Подорожко**, А. Н. Рябев**, В. И. Лозинский**
*Центр "Биоинженерия"РАН, Москва, 117312 **Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, 119991
e-mail: andryushina@rambler.ru Поступила в редакцию 17.02.2015 г.
Изучена стероидтрансформирующая активность свободных и иммобилизованных клеток Pimelo-bacter simplex ВКПМ Ас-1632, включенных в операционно-стабильный макропористый криогель поливинилового спирта. Показано, что макропористая матрица носителя не создает диффузионных затруднений для доступа стероида к клеткам и отвода из них продуктов биотрансформации. Подобраны оптимальные условия 1,2-дегидрирования гидрокортизона в преднизолон свободными и иммобилизованными клетками. Иммобилизованный биокатализатор получен в гранулированном виде и использован в 32 последовательных циклах трансформации стероида. Средняя продолжительность цикла составила 45 мин, а выход преднизолона в течение первых 20 циклов — 98%. Установлено, что иммобилизованные клетки актинобактерии P. simplex сохраняли высокую стероид-трансформирующую активность на протяжении всех этих циклов биотрансформации. Определены физико-механические и диффузионные характеристики криогелей поливинилового спирта и его гранул, показана их высокая стабильность в ходе многократных циклов биотрасформации стероида. Полученные результаты свидетельствовали о том, что иммобилизованные клетки P. simplex являются эффективным биокатализатором многократного действия. При его использовании снижалось потребление биомассы и существенно облегчалось выделение продукта реакции и хранение культуры.
Ключевые слова: иммобилизованный биокатализатор, Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632, стероид-трансформирующая активность, дегидрирование, гидрокортизон, преднизолон.
DOI: 10.7868/S0555109915050025
Биотрансформация стероидных гормонов включает процесс 1,2-дегидрирования молекулы стероида и используется при получении глюко-кортикоидов противовоспалительного и антиаллергического действия (гидрокортизон, предни-золон, триамцинолон, дексаметазон, флутика-зон и др.) [1], применение которых в связи с ухудшающейся экологией неуклонно растет как в нашей стране, так и за рубежом.
Стероиды практически не растворимы в водных средах и для их микробиологической трансформации обычно требуется тонкое измельчение субстанции или использование специальных со-любилизаторов (циклодекстринов и поверхностно-активных веществ). Многие стероиды и получаемые из них продукты токсичны для микроорганизмов. В связи с этим для биотрансформации таких соединений предпочтительно использовать иммобилизованные клетки, которые менее чувствительны к действию негативных факторов. Это позволяет не только обеспечить технологич-
ность процесса микробной биотрансформации, но и упростить выделение целевого продукта, а также удлинить срок продуктивного функционирования биомассы [2].
Актинобактерия Pimelobacter simplex штамм ВКПМ Ас-1632 обладает высокой 1,2-дегидроге-назной активностью [3]. Этот штамм бактерии способен вводить 1,2-двойную связь в Д4-3-кето-стероиды или в Д5-3-Р-гидроксистероиды с образованием кросс-сопряженной системы в кольце А молекулы стероида, обеспечивающей высокую биологическую активность стероидных медицинских препаратов прегнанового и андростанового рядов, а также соединений ряда холестана, являющихся ключевыми продуктами их синтеза.
Штамм ВКПМ Ас-1632 актинобактерий P. simplex обладает уникальным свойством расти в условиях отсутствия строгой стерильности, а также сохраняет активность при продолжительном (не менее 2 мес.) хранении иммобилизованной биомассы при 4°C [1]. Эти качества могут быть полезны при
получении дегидроаналогов стероида в промышленном масштабе. В процессе размножения данный штамм бактерий способен синтезировать и выделять в питательную среду экзополисахари-ды, которые облегчают контакт молекул гидрок-систероидов с бактериальной клеткой, необходимый для трансформации [3].
Для создания эффективного иммобилизованного биокатализатора (ИБК) для процесса 1,2-де-гидрирования стероидов в качестве носителя был использован гранулированный криогель поливи-нолового спирта (ПВС). Этот материал ранее был применен для иммобилизации клеток Arthrobacter globiformis и Rhodococcus erythropolis, катализирующих 1,2-дегидрирование стероидов и 9а-гидрок-силирование молекул андростанового и прегнано-вого рядов соответственно [4—6]. Макропористая матрица криогеля ПВС, формируемого методом замораживания-оттаивания [7, 8], обеспечивает незатрудненную диффузию субстратов и продуктов к иммобилизованным клеткам. Носитель обладает высокой абразивной устойчивостью и стабильностью в жидких средах разного состава [9], биосовместимостью и не токсичен. Он может использоваться повторно после инактивации биологических компонентов в составе ИБК.
Цель работы — получение иммобилизованной актинобактерии P. simplex ВКПМ Ас-1632, использование полученного биокатализатора в процессе 1,2-дегидрирования стероидов, а также разработка нового биотехнологического метода биотрансформации для получения высокоактивных дегидроаналогов.
МЕТОДИКА
Реагенты. В работе использовали следующие реактивы и компоненты питательных сред: агар-агар ("Difco", США), глюкоза ("ДиаМ", Россия), K2HPO4 ("х. ч.", "Реахим", Россия), кукурузный экстракт (КПК "Красный Профинтерн" № 1, КПЗ "Новлянский" № 2, "Усладский паточный завод" № 3, "Ибредькрахмалпатока" № 4, Россия), гидрокортизон, преднизолон и ацетат кортизона (индуктор) (Центр "Биоинженерия" РАН), Р-циклодекстрин (Р-ЦД, метил-Р-ЦД, МЦД), гидроксипропил- Р-ЦД (ГПЦД) ("Рокетт Рус", Россия) и ПВС ("AcrosOrganics", Бельгия).
Микроорганизмы. В работе использовали бактериальный штамм P. simplex ВКПМ Ас-1632 из коллекции Центра "Биоинженерия" РАН [3].
Среды для хранения и выращивания микроорганизмов. Бактерии хранили при 4°C в пробирках на скошенном агаре следующего состава (%): глюкоза — 1.0, кукурузный экстракт — 1.0, агар-агар — 2.5, вода водопроводная, рН до стерилизации доводили до 6.8—7.0 10%-ным раствором NaOH.
Для накопления биомассы бактериальную культуру выращивали на кукурузно-глюкозной (КГС) и овсяно-глюкозной средах (ОГС) при рН 7.0—7.2. КГС имела следующий состав (г/л): кукурузный экстракт — 10.0, глюкоза — 10.0, К2НР04 — 1.0 и деминерализованная вода — 1 л; ОГС (г/л): овсяные хлопья — 30.0, глюкоза — 10.0 и деминерализованная вода 1 л. Для доведения рН до 7.0—7.2 использовали 10%-ный раствор NaOH. Среду разливали по 100 мл в конические колбы объемом 750 мл.
Анализ продуктов реакции. Содержание пред-низолона, образующегося при использовании ИБК, оценивали методом ВЭЖХ на хроматографе ("Gilson", США), с колонкой (4.0 х 250 мм) с Silasorb С-18 зернением 10 мкм, детекция при 254 нм. Скорость потока 0.8 мл/мин. Подвижная фаза МеОН—Н2О (70 : 30). О ходе процесса и его окончании судили по ТСХ на пластинках "Sorb-fil" ("Imid Ltd", Россия) в системе хлороформ— ацетон 9 : 1.
Получение биомассы P. simplex BKПМ Ас-1632 для проведения трансформации. Биомассу в возрасте 5—7 сут смывали со скошенной агаризован-ной среды и переносили в конические колбы объемом 750 мл со 100 мл КГС (ОГС) и выращивали в течение 65—70 ч при 28°C на качалке при 220 об./мин. Полученный инокулят (10 об. %) переносили в колбы с КГС (или ОГС) и выращивали в течение 24 ч в тех же условиях. Через 6—8 ч роста культуры в среду КГС (или ОГС) вносили раствор (20 мг в 1 мл этанола) индуктора 1,2-дегидрогеназы ацетата кортизона в этаноле. После 24 ч роста клетки отделяли центрифугированием при 2500 g и 4°С. Полученную биомассу распределяли равными порциями в пробирки и замораживали при —18°С.
Иммобилизация клеток. Биомассу (2.16 г в пересчете на вес сухих клеток), полученную центрифугированием при 2500 g из 1.2 л культуральной жидкости, иммобилизовали в гранулах криогеля ПВС в соответствии с методикой [10]. Гранулы ИБК диаметром 2 мм формировали с помощью специальной криогрануляционной установки [11] из 10%-ной (по влажной биомассе) суспензии клеток в 10%-ном водном растворе ПВС. После криогенной обработки при —15°С и инкубации в замороженном состоянии в течение 18 ч проводили оттаивание полученных гранул (220 мл) в течение 6 ч при 4°С, затем их промывали стерильным физиологическим раствором и инкубировали в среде КГС в течение 24 ч.
Трансформация гидрокортизона, катализируемая ИБК. Гранулы отделяли от питательной среды с помощью мелкоячеистого сита, ресуспенди-ровали в водном растворе Р-циклодекстрина, содержащем соответствующее количество (6, 8 или 10 г/л) гидрокортизона, и помещали на качалку для проведения трансформации. Об окончании ре-
акции судили по результатам ТСХ. После завершения трансформации гранулы отделяли от среды, промывали физиологическим раствором и использовали в следующем цикле биотрансформации гидрокортизона. Из отделенной среды (водной фракции) трижды экстрагировали стероид этилацетатом до полного извлечения. Экстракт упаривали в вакууме, образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали на фильтре диэтиловым эфиром и высушивали. Полученный преднизолон содержал 98% основного вещества с т. пл. 230—231°С.
Все последующие циклы трансформации осуществляли, используя ту же партию ИБК. После окончания трансформации гранулы помещали в физиологический раствор и хранили в течение 48-72 ч при 4°C.
Физико-химические характеристики носителя и
ИБК. Формирование препаратов криогелей ПВС и последующее измерение их физико-механических характеристик осуществляли в разъемных цилиндрических дюралюминовых контейнерах с внутренним диаметром 15 мм и высотой 10 мм. Условно-мгновенный модуль сдвига (G0) и модуль сдвига в течение 30 мин (G30) при пенетрации в криогель сферического индентора диаметром 5 мм при постоянной нагрузке 4.9 х 10-3 Н определяли при 21 ± ± 1°С с помощью динамометрических весов Карги-на-Соголовой [12] в соответствии с ранее описанной методикой [13]. Физико-механиче
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.