БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 5, с. 735 - 745
УДК 577.577.23
НОВЫЙ КАТИОННЫЙ МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ РАЗОБЩИТЕЛЬ С^1 ЭФФЕКТИВЕН В БОРЬБЕ С ОЖИРЕНИЕМ У МЫШЕЙ
© 2015 А.В. Калинович12*, И.Г. Шабалина12
1 Стокгольмский университет, Институт им. Веннера Грена, отдел молекулярно-биологических наук, Швеция, Стокгольм; факс: +46 8 164209, электронная почта: anastasia.kalinovich@su.se, irina.shabalina@su.se
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва
Поступила в редакцию 19.01.15 После доработки 30.01.15
Ожирение ассоциируется с преждевременной смертностью, пониженным качеством жизни и большими затратами на поддержание здоровья, однако эффективность его терапии в настоящее время крайне низка. Целью данной работы стало изучение влияния нового митохондриального катионного разобщителя С4М (производного родамина 19) на ожирение у мышей линии С57В1/6, которые в течение восьми недель содержались на жировой диете в термонейтральных условиях. Экспериментальная группа мышей принимала С4Я1 в питьевой воде последовательно в двух дозах (30 и 12—14 мкмоль/кг в сутки) в общей сложности в течение 30 дней. Действие препарата зависело от дозы. Через шесть дней после приема С4Я1 в дозе 30 мкмоль/кг в сутки потребление пищи уменьшилось на 68%, масса тела — на 19%, масса жировой компоненты тела — на 21%. Потеря веса объяснялась как сниженным потреблением пищи, так и ускоренным метаболизмом, вероятно, вследствие разобщения митохондрий. Уменьшение жировой компоненты массы тела под воздействием С4Я1 сопровождалось снижением дыхательного коэффициента до максимально низкого уровня (0,7). Примечательно, что классический разобщитель 2,4-динитрофенол при суточной дозе 27 мкмоль/кг массы тела не изменял изучаемые параметры. Наша работа вносит вклад в поиск митохондриальных разобщителей как эффективных препаратов в борьбе с ожирением.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: катионный митохондриальный разобщитель, 2,4-динитрофенол, ожирение, скорость метаболизма, энергозатраты.
Количество людей, страдающих ожирением, значительно выросло в течение последних десятилетий — в настоящее время более миллиарда взрослых и детей имеют избыточную массу тела. Ожирение играет существенную роль в развитии многих патологий, таких как диабет, гипер-липидемия, сердечно-сосудистые заболевания и рак [1, 2]. Ожирение можно преодолеть либо повышая энергозатраты с помощью увеличения физической активности и/или теплопродукции, либо уменьшая поступление энергии (пищи). Многочисленные диеты могут успешно снижать массу тела и быть полезными для здоровья в це-
Принятые сокращения: ДНФ — 2,4-динитрофенол; МРТ — магнитно-резонансная томография; ДК — дыхательный коэффициент; C4R1 — производное родамина с короткой алкильной цепью; UCP1 — разобщающий белок 1 (uncoupling protein 1).
* Адресат для корреспонденции.
лом, однако более 90% пациентов в конечном итоге набирают потерянный вес [2, 3]. Фармакологическое лечение может стать долгожданным способом преодоления ожирения и его осложнений в тех случаях, когда не удается контролировать вес с помощью физических нагрузок и ограничения питания.
Митохондриальные разобщители окислительного фосфорилирования рассматриваются в качестве возможных средств терапии ожирения [1, 4, 5]. Разобщитель 2,4-динитрофенол (ДНФ) использовался для этой цели в 30-х годах прошлого столетия [6, 7], однако вскоре был запрещен из-за высокой токсичности. ДНФ представляет собой слабую кислоту, которая действует в качестве протонофора: проникая через мембрану внутрь митохондрий в нейтральной протонированной форме, он теряет протон и возвращается в анионной форме, используя энергию трансмембранного потенциала. Таким
образом, ДНФ увеличивает протонную проводимость мембраны митохондрий и энергозатраты организма [8—10].
В настоящее время ДНФ широко используется как модельный препарат для изучения влияния митохондриального разобщения на энергетический баланс в организме, митохондриаль-ные механизмы адаптации, механизмы развития окислительного стресса и старение [9—13]. Длительное применение низких доз ДНФ уменьшало массу тела подопытных мышей, нормализо-вывало содержание глюкозы, триглицеридов и инсулина в крови и увеличивало продолжительность жизни [11]. В другом исследовании положительный эффект ДНФ на массу тела и метаболические параметры подтвердился, однако также было показано отрицательное действие препарата на сократительную активность скелетной мускулатуры [9]. В экспериментах на выделенном сердце низкие концентрации ДНФ вызывали значительное укорочение интервала QT на электрокардиограмме и мерцание желудочков сердца [14]. Подобные побочные эффекты в отношении жизненно важных органов в сочетании с узким терапевтическим диапазоном концентраций (небольшой разницей между эффективной и летальной дозами [6, 15]) исключают ДНФ из списка препаратов для борьбы с ожирением [16].
За последние годы были разработаны альтернативные катионные разобщители [17, 18], в т.ч. производные родамина 19 [19, 20]. Положительный заряд позволяет им целенаправленно поступать в митохондрии. Кроме того, действие данных разобщителей линейно зависит от величины мембранного потенциала, т.е. является саморегулирующимся [21]. Благодаря такой саморегуляции, а также способности специфически накапливаться в митохондриях и, предположительно, низкой токсичности новые катионные разобщители рассматриваются в качестве перспективных средств для лечения ожирения.
Производное родамина с длинной алкиль-ной цепью, C12R1, увеличивает протонную проводимость искусственных липидных мембран и разобщает окислительное фосфорилирование в изолированных митохондриях и целых клетках [19, 20]. Другое производное родамина с более короткой алкильной цепью, C4R1, обладает, напротив, низкой протонофорной активностью на искусственных липидных мембранах, однако разобщает митохондрии даже более эффективно, чем C12R1 [20].
Целью данного исследования стало изучение действия нового катионного разобщителя C4R1 in vivo на склонных к ожирению мышах линии C57B1/6, содержащихся на диете с высоким со-
держанием жира в термонейтральных условиях (30°). Известно, что мыши, живущие при низкой температуре окружающей среды, активно вырабатывают тепло для поддержания нормальной жизнедеятельности [22, 23], и эта дополнительная теплопродукция маскирует эффект разобщителя [10, 24]. Довольно часто препараты, направленные на борьбу с ожирением, снижают потребление пищи. Игнорирование этого фактора приводит к преувеличению роли повышенных энергозатрат в снижении веса [25, 26]. С целью различения эффектов препарата, зависящих и независящих от потребления пищи, в наш эксперимент была дополнительно включена группа мышей попарного кормления. Задачей данного исследования было также сравнение обнаруженных эффектов C4R1 с эффектами классического разобщителя ДНФ. Известно, что ДНФ разобщает митохондрии в концентрации, в 10 раз большей, чем C4R1 ([20] и [27] для сравнения). Однако данные о действующей дозе ДНФ in vivo очень противоречивы (эффективные дозы отличаются в 1000 раз [9, 11]). В нашей работе мы изучили действие ДНФ в дозе, сравнимой с дозой C4R1.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Содержание животных. В исследовании было использовано 30 самцов мышей линии C57B1/6J возраста 7—8 недель (на начало эксперимента). Мыши содержались в термонейтральных условиях (30°) и получали диету с высоким (45%) содержанием жира (D12451, «Research Diets Inc.», США) в течение восьми недель до начала эксперимента, чтобы вызвать ожирение, и на протяжении всего эксперимента. Свет в комнате с животными включался в 8.00 утра и выключался в 20.00. Мыши содержались поодиночке в индивидуальных клетках с добавлением опилок, наличием картонного цилиндра для укрытия и бумаги. Эксперимент одобрен комитетом по этике г. Стокгольм.
Назначение C4R1, ДНФ и измерение основных физиологических параметров. Перед началом эксперимента с C4R1 мыши были разделены на три группы согласно массе тела и массе жировой компоненты массы тела: пять мышей в первой контрольной группе, пять мышей во второй контрольной группе и пять мышей в экспериментальной группе. Экспериментальная группа получала еду ad libitum и препарат C4R1 с питьевой водой. C4R1 был первоначально растворен в 95%-ном этаноле до концентрации 0,25 М и затем разбавлен в 30 мл питьевой воды до определенной концентрации с учетом веса животного.
Концентрация препарата и продолжительность его потребления варьировали на разных этапах: первый этап продолжался шесть дней, [C4R1] = = 0,39—0,41 мМ (в зависимости от массы тела животного), второй этап — в течение последующих 16 сут, [C4R1] = 0,19-0,21 мМ. На 22-й день эксперимент был прерван на шесть дней и затем возобновился в течение восьми суток, [C4R1] = = 0,19-0,21 мМ. Первая контрольная группа получала еду ad libitum и питьевую воду с соответствующей концентрацией бромида натрия и этанолом (0,08-0,16%), поскольку C4R1 был в форме бромида и первоначально растворен в этаноле. Вторая контрольная группа получала питьевую воду с теми же добавками, что и первая контрольная группа, но столько еды, сколько экспериментальные мыши съедали за предыдущие 1-2 дня (так называемое попарное кормление).
Воду меняли каждые 4-5 дней. Количество потребляемой еды и воды измеряли каждые 1-2 дня. Потребление воды использовалось для подсчета дозы препарата (мкмоль/кг массы тела в сутки). Вторая контрольная группа получала суточную порцию еды ежедневно в 20.00 перед началом активного ночного периода, чтобы не нарушать естественные суточные ритмы мышей. По этой же причине потребление пищи, воды и массу тела измеряли каждые 1-2 дня также в 20.00. Состав тела - липидную (жировую) компоненту массы тела и безлипидную (безжировую) компоненту массы тела - измеряли с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) на EchoMRI-100 («EchoMRI», США) дважды до начала эксперимента с назначением C4R1, а также непосредственно перед его началом (0-й день), на второй, шестой и пятнадцатый дни эксперимента. Следует подчеркнуть, что жировая компонента массы тела, измеряе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.