МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 575.22:595.773.4
НОВЫЙ КОНСЕРВАТИВНЫЙ ДОМЕН КОАКТИВАТОРА SAYP ОПОСРЕДУЕТ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ КОМПЛЕКСОВ TFIID И Brahma
© 2010 г. Н. Е. Воробьева1*, Н. В. Сошникова1, Ю. В. Николенко1, Ю. Л. Кузьмина1, Е. Н. Набирочкина1, С. Г. Георгиева1, 2, Ю. В. Шидловский1, 3
1 Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 117984 3 Центр медицинских исследований Университета Осло, Москва 119334 Поступила в редакцию 25.12.2009 г. Принята к печати 10.03.2010 г.
В системе клеток S2 Drosophila melanogaster показано, что ключевым доменом, определяющим взаимодействие коактиваторных комплексов TFIID и Brahma в составе суперкомплекса BTFly, является эво-люционно консервативный домен SAY белка SAYP. Коактиваторы TFIID и Brahma участвуют в процессе активации транскрипции доменом SAY репортерного гена внутри клеточного ядра. В составе комплексов TFIID и Brahma идентифицированы компоненты, взаимодействующие с доменом SAY.
Ключевые слова: транскрипционные факторы, активация транскрипции, промотор, ремоделирующие хроматин комплексы, соосаждение, эукариоты.
NOVEL CONSERVATIVE DOMAIN OF SAYP COACTIVATOR MEDIATES TFIID AND Brahma TRANSCRIPTIONAL COMPLEXES INTERACTION, by N. E. Vorobyeva1, N. V. Soshnikova1, J. V. Nikolenko1, S. G. Georgieva1, 2, E. N. Nabirochkina1, Yu. V. Shidlovskii1, 3 ^Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; *e-mail: nvorobyova@gmail.com; 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 3University of Oslo, Center for Medical Studies, Moscow, 119334 Russia). In the S2 cell system of Drosophila melanogaster a key protein domain mediating the interaction of TFIID and Brahma transcriptional complexes into the BTFly supercomplex has been shown to be an evolutionary conserved SAY domain of the SAYP. TFIID and Brahma coactivators participated in the reporter gene activation induced by the SAY domain in cellular nuclei. The TFIID and Brahma components directly interacting with the SAY domain were identified.
Key words: transcriptional factor, activation of transcription, promoter, chromatin remodeling complexes, co-precipitation, eukaryotes.
Белок SAYP описан как транскрипционный фактор, необходимый для активированной экспрессии гена yellow у Drosophila melanogaster [1]. Позднее в нашей лаборатории этот белок охарактеризовали и нашли его гомологи в других организмах [2]. Все белки, гомологичные SAYP, имеют консервативную область, названную "SAY-до-меном". SAY-домен активирует транскрипцию в двугибридной системе дрожжей. Кроме того, все гомологи SAYP имеют в своем составе PHD-до-
мены. Хотя гомологи SAYP достаточно сильно различаются между собой по длине аминокислотной последовательности, их доменная организация, включающая домены SAY и PHD, идентична. Недавно показано, что белок человека PHF10, гомолог SAYP, играет важную роль в регуляции экспрессии генов млекопитающих. PHF10 — компонент подтипа PBAP комплекса Brahma, специфичный для стволовых клеток мозга мыши [3]. Позднее в нашей лаборатории проведена биохи-
Принятые сокращения: Brahma — белковый комплекс, ремоделирующий хроматин, коактиватор транскрипции; Gal4 BD — ДНК-связывающий домен активатора Gal4; GCN5 — ацетилтрансфераза комплекса SAGA, модифицирующего хроматин; PHD (PlantHomeoDomain) — гомеодомен, обнаруженный у растений; pSK — участок плазмиды pBlueskriptKSII(-), используемый в качестве отрицательного контроля при проведении РНК-интерференции; SAYP (Supporter of Activation of Yellow Protein) — белок, поддерживающий активированную экспрессию гена yellow; TFIID (Transcriptional Factor II D) — общий фактор транскрипции PolII D.
* Эл. почта: nvorobyova@gmail.com
867
8*
мическая очистка комплекса, образуемого SAYP [4], и показано, что, как и PHF10, SAYP взаимодействует с подтипом PBAP комплекса Brahma. Кроме того, белок SAYP взаимодействует с комплексом TFIID. Образуемый SAYP комплекс, включающий в себя коактиваторы TFIID и Brahma, получил название суперкомплекса BTFly (Brahma and TFIID in one assembly).
В нашей предыдущей работе продемонстрирована способность консервативного домена SAY активировать транскрипцию репортерного гена в клетках S2 D. melanogaster и показано, что активность домена SAY зависит от уровня компонентов комплексов TFIID и Brahma [5].
Цель данной работы — изучение взаимодействия домена SAY с транскрипционными комплексами TFIID и Brahma, а также поиск белков-партнеров коактиватора SAYP в составе этих комплексов. В результате показано, что именно домен SAY белка SAYP опосредует взаимодействие транскрипционных комплексов TFIID и Brahma, идентифицированы компоненты этих комплексов, с которыми взаимодействует домен SAY и предложен механизм формирования единого транскрипционного суперкомплекса BTFly.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение линий клеток, стабильно экспресси-рующих SAY в составе конструкции pTTAssay. Для
экспрессии домена SAY в клетках S2 D. melano-gaster использована конструкция, предназначенная для изучения способности белковых доменов активировать транскрипцию [5]. Последовательность, кодирующая домен SAY, клонирована в конструкцию pTrAssay таким образом, чтобы после трансфекции экспрессировался домен SAY, слитый с Gal4 BD и маркированный тройным FLAG-эпитопом.
При получении стабильно трансфицирован-ной клеточной линии сначала проводили ко-трансфекцию клеток S2 плазмидной конструкцией, а также конструкцией pCoBlast ("Invitrogen"), несущей ген устойчивости к бластицидину и взятой в молярном соотношении 1/20 по отношению к исходной плазмиде. При проведении трансфек-ции использовали реагент Effecten ("Qiagen"). Затем проводили селекцию, культивируя клетки не менее одного месяца на среде, содержащей бла-стицидин (в конечной концентрации 25 мкг/мл). Чтобы убедиться в том, что все клетки в культуре экспрессируют искомый слитый белок, проводили иммуноокрашивание с применением анти-FLAG мышиных антител ("Sigma"). Присутствие конструкции pTrAssay во всех клетках дополнительно подтверждали гибридизацией in situ.
РНК-интерференция в клетках стабильной линии, экспрессирующей SAY-домен. За сутки до экс-
перимента клетки S2 рассаживали на 30-мм чашки Петри в среду Schneider's Insect Medium ("Sigma") с 10%-ной эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (из расчета 1 млн. клеток на одну чашку). Непосредственно перед проведением эксперимента из чашки удаляли среду для клеток S2, заменяя ее 1 мл бессывороточной среды, в которую по каплям добавляли 15—20 мкг дцРНК. Клетки выдерживали при комнатной температуре в течение 40—50 мин, а затем добавляли 2 мл среды, содержащей 15% эмбриональной сыворотки (конечная концентрация сыворотки в среде 10%). Клетки растили в термостате при 25°С в течение 4 сут, а затем анализировали.
Двухцепочечную РНК синтезировали при помощи MEGAscript T7 Kit ("Ambion") согласно рекомендациям производителя. ДНК-матрицы для синтеза дцРНК амплифицировали методом ПЦР со следующими парами праймеров:
TAF5 (5'-GAATTAATACGACTCACTATAGGGA-GA-TTTGGGAGCTGGCGATG и 5'-GAAT-TAAT-ACGACTCACTATAGGGAGAATCGTCCTCCTCCT-CTGGTG); TAF4 (5'-GAATTAATACGACT-CACTATAGGGAGATATGACCAACACGACCGCCA CCAG и 5'-GAATTAATACGACTCACTATAGGGA-GATTCCTCCAGTGTTGACGAGACGCG); PB (5'-GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTCGA-TCCCACAGAACTGTGCCAG и 5'-GAATTAATAC-GACTCACTATAGGGAGACGCTGCGTAAAGATC-CGTTTCAGG) ; BAP170 (5'-GAATTAATACG-ACTCACTATAGGGAGACCGCCCAATTACAGATC ATG и 5'-GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGA-CAGCACATCAAGCAGTTTGG); GCN5 (5'-GAA-TTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGAATG-TCTGGTGGTCC и 5'-GAATTAATACGACTCAC-TATAGGGAGAGACGGCGATTCAAAGTTG) ; pSK (отрицательный контроль, 5'-GAATTAATACGACT-CACTATAGGGAGAGTTACATGAT CCCCCATG и 5'-GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATTTC-GCCCCGAAGAACG).
Иммуноокрашивание клеток S2. Для проведения иммуноокрашивания клетки S2 помещали на покровные стекла, дважды промывали фосфат-но-солевым буфером (ФСБ) и в течение 10 мин фиксировали в 3.7%-ном растворе формальдегида в том же буфере. Затем клетки пермеабилизо-вали 0.2%-ным раствором Тритон X-100 в ФСБ в течение 5 мин и блокировали в течение 10 мин в 3%-ной суспензии сухого молока в ФСБ. Первичные антитела (в разведении 1 : 500) в 3%-ной суспензии сухого молока добавляли к клеткам и инкубировали во влажной камере в течение 60 мин при комнатной температуре. В качестве вторичных использовали антитела к IgG кролика, конъ-югированные с флуоресцентным красителем Cy3 (550/570 нм, "Amersham"), а также антитела к IgG мыши, конъюгированные с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488 (495/519 нм, "Molecu-
lar Probes", США). После инкубации с первичными антителами клетки промывали ФСБ (3x5 мин), в течение 1 ч инкубировали во влажной камере со вторичными антителами, разведенными в 500 раз 3%-ным молоком, после чего клетки трижды промывали ФСБ и помещали в среду для им-мунофлуоресценции Vfectashield Mounting Medium ("Vector laboratories", Великобритания). Окрашивание клеток анализировали на флуоресцентном микроскопе DMR/HC5 (Leica Microsystems GmbH, Германия).
Совмещенная с иммуноокрашиванием гибридизация in situ. Клетки S2 наносили на покровные стекла, дважды промывали ФСБ, фиксировали в 3.7%-ном растворе формальдегида в течение 15 мин, пермеабилизовали 0.5% раствором Тритона X-100 в течение 10 мин. Далее, чтобы денатурировать ДНК, клетки инкубировали в растворе формамид : двукратный буфер SSC (Saline-Sodium Citrate buffer — натриевый солевой цитратный буфер, состоящий из растворов 3M NaCl и 0.3 М Na3C6H5O7 • 5.5H2O) в соотношении 1 : 1 в течение 5 мин при 95°С и затем в течение 5 мин при 4°С. После этого проводили дегидратацию клеток, последовательно промывая их 70, 90 и 100% этанолом при 4°С. К дегидратированным клеткам добавляли гибридизационную смесь с биотинили-рованным ДНК-зондом. В качестве матрицы для получения зонда использовали последовательность Gal4 BD, которую амплифицировали методом ПЦР и метили биотинилированным dUTP при помощи набора Biotin-Nick Translation Mix ("Roche"). Би
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.