ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 52-58
УДК: 606
НОВЫЙ МЕТОД ИММОБИЛИЗАЦИИ АРГИНАЗЫ I С ПОМОЩЬЮ ЦЕЛЛЮЛОЗОСВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА, ПОЛУЧЕНИЕ L-ОРНИТИНА © 2014 г. М. Ли, Дж. Янг, Х. Чу, К. Чжан, Ф. Бай, Г. Бай
Фармацевтический колледж и Ведущая исследовательская лаборатория молекулярной разработки лекарств,
Нанкинский университет, 300071 Тяньцзинь, Китай e-mail: qizhang@nankai.edu.cn Поступила в редакцию 4.12.2012 г.
Получен рекомбинантный штамм Escherichia coli pET35b-ARG, обладающий способностью к сверхэкспрессии аргиназы I, слитой с целлюлозосвязывающим доменом (ЦСД). Аргиназа I с помощью ЦСД была иммобилизована на целлюлозных микросферах. При проведении реакции в оптимальных условиях при 40°С, рН 9.5, в присутствии 1.0 мМ Mn2+, 30 мкл/мл иммобилизованного фермента и 30 г/л L-Арг в течение 1 ч степень конверсии L-Арг составила 98.7%. После 7-кратного использования в реакции 30 мкл иммобилизованного фермента в 1.0 мл раствора было получено 153 мг L-Орн 97.3%-ной чистоты. Полученные результаты показали эффективность разработанного метода иммобилизации и перспективность его использования для получения L-Орн.
DOI: 10.7868/S0555109913060111
Ь-орнитин (Ъ-Орн) — небелковая аминокислота, промежуточный метаболит в цикле мочевины [1]. Аминокислота является предшественником при биосинтезе полиаминов, участвующих в клеточном росте и биосинтезе белка [2]. Ь-Орн может также служить предшественников в биосинтезе нейромедиатора глутамата, который в свою очередь может быть предшественником ингиби-торного нейромедиатора гамма-аминомасляной кислоты. Ь-Орн может также выполнять функции нейромедиатора [3].
Существуют три основных способа промышленного получения Ь-Орн: химический синтез, синтез с помощью ферментов и ферментация микроорганизмов-продуцентов. При химическом синтезе получается смесь ЭЬ-форм аминокислоты, поэтому в дальнейшем необходимы дополнительные стадии очистки для получения биологически активного Ь-изомера [4]. Ферментативный синтез получения Ь-Орн может ингибироваться продуктом реакции, кроме того исходные реагенты для ферментативного синтеза Ь-Орн не являются легкодоступными [5].
Аргиназа (КФ 3.5.3.1) — конечный фермент цикла мочевины, может превращать Ь-аргинин (Ъ-Арг) в мочевину и Ь-Орн. Аргиназы широко распространены в природе и присутствуют в различных организмах от бактерий до человека. У млекопитающих было обнаружено две изоформы аргиназы. Аргиназа I является цитозольным ферментом, который в значительном количестве экспрессируется в печени и катализирует большую часть специфичных для него реакций в организме [6].
В качестве катализатора фермент должен обладать высоким уровнем активности, а также высокой селективностью и специфичностью и его получение может быть усовершенствовано до внедрения в промышленное производство. Метод иммобилизации явлется эффективным инструментом улучшения практически всех свойств фермента [7]. В наших более ранних исследованиях, мы разработали новый метод иммобилизации белков на магнитных целлюлозных микросферах, используя предварительную модификацию белков путем слияния с целлюлозосвязывающим доменом (CBD) [8]. Преимуществами такого метода являются его удобство, простота и эффективность, а также отсутствие токсичных соединений. При иммобилизации фермента такой белок способен связываться с целлюлозными зернами посредством домена CBD. При разработке нового способа иммобилизации фермента была проведена также оптимизация концентрации реагентов для сшивки, исследованы условия проведения катализа иммобилизованным ферментом, возможность повторного использования фермента при оптимальных условиях. Наши результаты показали, что иммобилизация аргиназы I на микросферах является перспективным, экологически чистым методом производства L-Орн, который может иметь промышленное значение.
Цель исследования — получение рекомби-нантного штамма Escherichia coli, экспрессирую-щего модифицированный белок, содержащий целлюлозосвязывающий домен (CBD), и аргиназу I (CBD-ARG) и иммобилизация его на целлюлозных микросферах.
МЕТОДИКА
Материалы. Мыши линии китайский Кун Мин были получены из Военно-медицинской академии наук (Китай). Штамм E. coli BL21 (DE3) был получен на фирме "Stratagene" (США), плаз-мида рЕТ-35Ь (+) — в компании "Novagen" (США). Комплект реактивов для выделения ДНК, эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигаза Т4 были получены из "TaKaRa" (Япония). Реагент TRIzol был приобретен в "Sangon Biotech Co." (Китай). L-Орн и L-Арг были заказаны в "Alfa Aesar" (Китай), 1-фтор-2,4-Динитрофенил-5-L-Аланин (ФДФA) и CBD антитела были заказаны в "Sigma" (США). Другие химические вещества, используемые в работе, были аналитической чистоты.
ВЭЖХ-анализ образцов. Определение L-АРГ и L-Орн в образцах проводили с помощью ВЭЖХ, в сочетании с модифицированным методом пробо-подготоваки. Модификацию исследуемого образца перед анализом проводили следующим образом. Аликвоты (100 мкл) растворов, содержащих 10 мМ Na2CO3 (рН 9.0), L-Арг или L-Орн (25 мМ) помещали в 2 мл пластиковые пробирки. В каждую пробирку добавляли 200 мкл 1%-ного раствора ацетона, содержащего 18 мМ ФДФА, чтобы мольное отношение ФДФА и аминокислоты составляло 1.4 : 1. Растворы смешивали и нагревали на водяной бане при 40° С в течение 1 ч при интенсивном перемешивании. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси добавляли 20 мкл 2 н. HCl, смешивали и отбирали 20 мкл для исследования методом ВЭЖХ. Для проведения хроматографии использовали колонку C18 (Luna 5 ц, 100, 250 х 4.6 мм; "Phenomenex", США). Подвижная фаза состояла из 0.1%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ) (об./об.) (растворитель А), и ацетонитрила в 0.1%-ной ТФУ (об./об.) (растворитель В) в соотношении А—В = 45 : 55 об./об. ВЭЖХ проводили при комнатной температуре. Детекцию осуществляли при длине волны 340 нм и скорости потока 1 мл/мин.
Клонирование и экспрессия аргиназы I. Для получения РНК использовали печень мышей линии КМ и реагент TRIzol [9]. Обратную транскрипцию проводили с использованием комплекта сДНК-sintes-kit [9]. ДНК амплифицировали с использованием праймеров а^1 (5'-ATG GCG AAGCTT AGC TCC AAG AAG CCA TC-3') и а^2 (5'-GCC GGATCC AGG CTT TCA TGG TTT-3'). Амплифицированные фрагменты очищали, расщепляли и клонировали в BamH I и Hin III-сайты плазмиды рЕТ-35Ь (+). Полученную плазмиду обозначили pCBD-ARG. Плазмиду pCBD-ARG трансформировали в E. coli BL21 (DE3). Транс-
формированные клетки выращивали при 37°С в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина до достижения культурой OD600, равного 0.6. Синтез белка индуцировали с помощью 1.0 мМ изопро-пил^^-Тиогалактопиранозида (ИПТГ) при 37°C, после чего клетки растили дополнительно 2 ч, затем собирали центрифугированием и дважды промывали 0.01 М калий-фосфатным буфером, рН 7.2 (КФБ). Промытые клетки ресуспен-дировали в 10 мл 0.01 М КФБ и лизировали с помощью ультразвука (400 В, 3 с, пауза 3 с) в течение 5 мин. Клеточные дебрис удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 15 мин. Полученный супернатант анализировали методами электрофореза в ПААГ с Na-ДДС и вестерн-блоттинга и использовали для иммобилизации ферментов.
Вестерн-блоттинг-анализ. После разделения в ПААГ с Na-ДДС белки переносили на нитроцел-люлозную мембрану, как описано в работе [10]. Мембрану с нанесенными белками выдерживали в 5%-ном (сухой порошок) обезжиренном молоке в 0.01 М КФБ в течение ночи при 4°С, после чего мембрану инкубировали с мышиными антителами, специфичными к CBD, в течение 2 ч при 37°С. Затем мембрану промывали 5 раз буфером, содержащим 0.02 М КФБ с 0.15 М NaCl и 0.05%-ным твином 20. После промывания мембрану инкубировали с HRP-меченым антителами козы, специфичными к мышиным антителам в течение 1.5 ч при 37°С. После чего мембраны осторожно промывали буфером, описанным выше (КФБ с NaCl и твином) и окрашивали диаминобензидином [11].
Исследование активности фермента. Анализ активности CBD-ARG проводили с использованием реакции Сакагучи [12]. Реакционную смесь (600 мкл), содержащую 300 мкл раствора катализа-тализатора (25 мМ глицин-NaOH, рН 9.5, 1.0 мкМ MnCl2, 50 г/л L-Арг, 0.01 г клеток BL21/pCBD-ARG, по сухой массе, 37°С, 1 ч), 50 мкл 14%-ного NaOH (вес/об.), 100 мкл 1-пропанола и 150 мкл раствора 1-нафтола (4.0 г 1-нафтола, растворенного в 100 мл 1-пропанола с 25 мкл 2,3-бутандиола) инкубировали при 40°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали на ледяной бане. Через 30 мин измеряли ОП570 с помощью микропланшетного спектрофотометра "Bio-Rad" 680 (США). За единицу активности аргиназы I принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль L-Орн за 1 ч в условиях проведения реакции.
Подготовка зерен ЦММ. Зерна целлюлозных магнитных микросфер (ЦММ) были подготовлены, как это описано ранее [13], с незначительными модификациями процедуры, заключающейся в замене раствора, содержащего феррожидкости, на раствор с высокой вязкостью.
mv
800
600
400
200
1
л, 1 . ft \. .
0 5 10 15 20 25 мин
Рис. 1. ВЭЖХ-анализ L-Арг (1), L-Орн (2) и ФДФА(З).
Иммобилизация фермента. Для проведения иммобилизации аргиназы I, ЦММ инкубировали с избыточным количеством растворимой СБЭ-ЛЯО при 4°С в течение 12 ч. После чего ЦММ тщательно промывали КФБ до полного удаления белка из су-пернатанта.
Изучено влияние различных стабилизирующих агентов, а также влияние различных сшивающих реагентов. ЛЯО-СБЭ-ЦММ (1.0 мл) ресуспенди-ровали в 10 мл глутаральдегида (ГА) или в растворе диметилпимелимидатдигидрохлорида (ДПД), приготавливая серию разведений в КФБ, рН 7.2. Суспензию осторожно перемешивали при 25°С в течение 1 ч. После того как реакцию останавливали добавлением 1.0 М раствора глицина, супернатант удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 1 мин и гранулы промывали КФБ [14]. До и после обработки была протестирована ферментативная активность препарата для подбора реагента и его концентрации. Затем 1.0 мл иммобилизованной сшитой аргиназы I инкубировали в 10 мл реакционного раствора при 4°С в течение 48 ч с тем, чтобы определить скорость вымывания белка и изменения ферментативной активности [15].
Те
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.