БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 4, с. 411-415
УДК 57.083
НОВЫЙ ПРОСТОЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ КОЛИЧЕСТВ МЕЧЕНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ПОДБОРА ПАР В СЭНДВИЧ-ВАРИАНТЕ ИФА
© 2015 г. М. М. Зарипов*, Г. В. Афанасьева*, К. А. Глухова*, Ю. А. Тризна*, А. С. Глухов*, И. П. Белецкий**, О. В. Прусакова*, #
*ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3
**ООО "Инноград Пущино", г. Пущино Поступила в редакцию 12.11.2014 г. Принята к печати 12.12.2014 г.
Разработан простой и быстрый метод получения меченых моноклональных антител (мкАТ) из куль-туральной жидкости гибридом в количествах, достаточных для подбора пар антител в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа (ИФА) и определения их аффинности. Метод основан на предложенном впервые подходе, который заключается в аффинном связывании мкАТ из культу-ральной жидкости гибридом с молекулами антигена, сорбированными в 8-луночном планшете, и последующем кратковременном мечении образованных комплексов биотином. На примере мкАТ к ре-комбинантному белку вируса осповакцины Л27Ь показано, что количества меченных таким образом антител в лунке достаточно для проверки 25 потенциальных партнеров в сэндвич-варианте ИФА. Метод позволяет экономично и эффективно осуществлять подбор пар мкАТ, не имея больших количеств куль-туральной или асцитной жидкости и без проведения процедур выделения антител.
Ключевые слова:моноклональные антитела, сэндвич-вариант ИФА, биотин, вирус осповакцины.
БО1: 10.7868/80132342315030124
ВВЕДЕНИЕ
Гибридомная технология, разработанная Г. Ке-лером и С. Мильштейном еще в 1975 г. [1] успешно применяется во многих лабораториях в мире в своем первоначальном формате. Получение специфических моноклональных антител (мкАТ), как правило, требует серьезных усилий исследователей и финансовых ресурсов, не говоря уже об элементе удачи. В настоящее время вся процедура получения мкАТ занимает в лучшем случае около 70 дней. При необходимости получения мкАТ для сэндвич-варианта иммуноферментного анализа (ИФА), который требует наличия пары антител, неконкурентно связывающих антиген, временные и материальные затраты увеличиваются многократно. Традиционно поиск пар-кандидатов включает в себя получение достаточно большой представительной панели гибридом-продуцентов антигенспецифических мкАТ, наработку больших объемов культуральной или асцитной жидкости,
Сокращения: мкАТ — моноклональные антитела; рЛ27Ь — рекомбинантный белок Л27Ь вируса осповакцины; ФСБ — фосфатно-солевой буферный раствор, ООЕ — оспообразу-ющие единицы.
# Автор для связи (тел.: +7(4967) 73-94-41; факс: +7 (4967) 33-05-53; эл. почта: o_proussakova@mail.ru).
выделение мкАТ в миллиграммовых количествах, мечение очищенных антител и проведение множества иммуноферментных реакций в сэндвич-варианте. В связи с этим разработка подходов, позволяющих ускорить и упростить процедуры получения аналитических количеств меченых моноклональных антител для подбора пар в сэндвич-варианте ИФА, является актуальной задачей.
Цель настоящего исследования состояла в разработке простого и быстрого метода получения меченых моноклональных антител из культураль-ной жидкости гибридом в количествах, достаточных для подбора пар антител в сэндвич-варианте ИФА. В качестве антигена был использован рекомбинантный белок Л27Ь (рЛ27Ь) вируса осповакцины.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для разработки метода использовали 25 моно-клональных антител из гибридомных клонов, положительно отвечающих на рЛ27Ь. В качестве примера на рисунке представлены результаты иммуноблотинга 4 из 25 использованных мкАТ. Подобное окрашивание было получено и для остальных клонов. Концентрация антител в куль-
кДа М 120 -85 -
50 -35 -25 -
20
ЗАРИПОВ и др. 2 3 4 5
тятшят Г
*
A27L
Электрофореграмма (дорожка 1) и иммуноблот (дорожки 2—5) очищенного рекомбинантного белка осповакцины pA27L. Визуализация pA27L на иммуноблоте с помощью мкАТ 3.13 (дорожка 2), мкАТ 8 (дорожка 3), мкАТ 11.17 (дорожка 4), мкАТ 3.4 (дорожка 5), специфичных к pA27L. М — маркер молекулярной массы белков (Fermentas).
туральных жидкостях гибридом варьировала от 20 до 50 мкг/мл.
Для подбора оптимальных условий биотини-лирования была проверена эффективность мече-ния в различных буферных системах. Для этого процедура биотинилирования сукцинимидным эфиром биотина была выполнена в трех различных буферных растворах: фосфатно-солевом, боратном и карбонат-бикарбонатном. Оказалось, что при параллельном титровании препаратов мкАТ, биоти-нилированные в ФСБ, показывают максимальный сигнал по сравнению с мкАТ, биотинилированны-ми в других буферных системах. Все последующие эксперименты по подбору пар в сэндвич-варианте ИФА проводили с мкАТ, биотинилированными в ФСБ. Следует отметить, что только половина антител использованной панели эффективно био-тинилировалась. Мы предположили, что различная эффективность мечения может быть связана с различной аффиностью антител. Для того чтобы установить эту связь, аффинность антител была измерена методом Битти и др. [2] (таблица). Оказалось, что эффективное коньюгирование характерно, прежде всего, для антител с константой диссоциации 10-9—10-10.
Для подбора пар в сэндвич-варианте ИФА использовали те же мкАТ из 25 гибридомных клонов, положительно отвечающих на рЛ27Ь, и 12 биотинилированных антител с Кй ~ 10-9—1010.
В результате было обнаружено более 150 пар мкАТ-антител, пригодных для сэндвич-варианта ИФА. Отобранные пары мкАТ были проверены в непрямом сэндвич-варианте ИФА с использованием вируса осповакцины в качестве антигена. Оказалось, что 104 пары анти-рЛ27Ь-мкАТ способны выявлять вирус осповакцины (таблица). Среди них 4 пары анти-рЛ27Ь-мкАТ позволяют обнаруживать вирусные частицы в концентрации 103 ООЕ/мл в сэндвич-варианте ИФА.
Таким образом, разработан простой и быстрый метод получения высокоаффинных меченных биотином моноклональных антител из культу-ральной жидкости гибридом в количествах, достаточных для подбора пар антител в сэндвич-варианте ИФА.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ДНК, кодирующую Л27Ь, синтезировали методом ПЦР с перекрывающимися олигонуклео-тидами, как было описано ранее [3]. Для конструирования праймеров использовали последовательность, аннотированную в базе данных GenBank ^С 006998). Конечный продукт ПЦР содержал на 5'- и З'-концах участки расщепления для эндо-нуклеаз рестрикции NdeI и ХЪо1 соответственно. кДНК-фрагмент Л27Ь клонировали в вектор рЕТ29Ь+ (№уа§еп). Правильность последова-
Активность пар первичных (мкАТ №№) и биотинилированных мкАТ (№-био) в сэндвич-варианте ИФА, выраженная в значениях ОП490
кй, м мкАТ, №№ 1-био 2.10-био 2.14-био 3.4-био 8-био 11.17-био 14-био 64-био 102-био 180-био 188-био 012/2-био
1.7 х 1(Г10 1 - 0.245 + 0.008 0.331 +0.009 0.218 ± 0.014 0.318 ± 0.016 0.189 + 0.008 0.188 ± 0.01 0.533 ± 0.011 0.245 ± 0.011 0.209 + 0.022 0.212 ± 0.01 0.201 ± 0.012
3.3 х 1(Г10 2.10 1.166 ± 0.034 - 0.264 + 0.008 0.274 + 0.013 0.277 + 0.01 0.254 + 0.013 0.205 + 0.005 0.432 + 0.012 0.241 ± 0.017 0.224 + 0.013 0.241 + 0.014 0.234 + 0.023
5.5 х 1(Г8 2.13 0.554 + 0.027 1.131 ± 0.002 0.977 + 0.013 1.44 + 0.019 1.106 ± 0.014 1.34 ± 0.012 0.344 + 0.007 1.012 + 0.011 1.324 ± 0.012 0.246 + 0.014 1.3 + 0.012 1.439 ± 0.016
9.2 х 1(Г9 2.14 0.235 + 0.036 0.231 +0.008 - 0.243 + 0.015 0.219 ± 0.013 0.278 + 0.01 1.247 ± 0.021 1.305 ± 0.019 0.247 + 0.013 0.219 ± 0.021 0.212 ± 0.01 0.202 + 0.016
0.7 х Ю~8 2.7 1.233 + 0.025 0.931 ± 0.012 1.244 + 0.012 1.13 + 0.012 0.761 ± 0.019 1.327 + 0.01 0.212 ± 0.01 0.213 + 0.011 1.14 + 0.019 0.245 + 0.012 1.418 ± 0.015 1.022 ± 0.01
2.2 х КГ8 3.13 0.23 + 0.013 0.377 + 0.01 1.441 + 0.009 1.108 + 0.018 1.461 + 0.009 1.114 ± 0.022 1.279 ± 0.021 1.432 ± 0.01 0.331 ± 0.012 1.334 ± 0.019 1.207 ± 0.018 1.356 ± 0.015
0.1 х Ю"9 3.20 0.333 + 0.008 0.434 + 0.006 0.545 + 0.007 0.274 + 0.016 1.311 + 0.012 1.211 + 0.015 1.145 + 0.016 0.191 ± 0.014 0.324 + 0.019 1.148 + 0.011 1.344 + 0.012 1.241 ± 0.019
1.2 х Ю"10 3.4 0.24 + 0.005 0.209 ± 0.011 0.208 + 0.015 - 0.239 ± 0.011 0.189 + 0.005 0.191 + 0.011 0.2 + 0.017 0.222 + 0.014 0.218 ± 0.012 0.239 + 0.016 0.195 + 0.024
1.3 х Ю"10 8 0.142 + 0.008 0.339 + 0.007 0.266 + 0.012 0.165 + 0.011 - 0.215 + 0.02 0.232 +0.013 0.324 + 0.019 0.621 ± 0.013 0.207 + 0.012 0.205 + 0.019 0.234 + 0.017
9.6 х Ю~7 9 1.342 + 0.008 1.029 + 0.024 1.261 + 0.01 1.129 ± 0.014 1.109 ± 0.024 1.111 + 0.014 0.241 + 0.01 1.141 + 0.013 0.205 + 0.014 1.115 + 0.023 1.333 + 0.022 1.015 + 0.015
5.5 х Ю"9 11.17 0.534 ± 0.011 0.453 + 0.012 0.212 ± 0.01 0.202 +0.013 0.204 + 0.012 - 1.002 ± 0.018 0.827 + 0.016 0.324 + 0.013 0.231 ± 0.016 0.271 ± 0.013 0.248 + 0.01
5.9 х КГ9 14 0.625 + 0.008 0.517 + 0.007 0.762 + 0.008 1.206 + 0.008 0.32 + 0.008 1.213 ± 0.025 - 1.424 ± 0.011 0.231 ± 0.012 0.241 + 0.014 0.707 ± 0.011 0.936 + 0.013
1.1 х Ю"8 39 1.129 ± 0.003 1.306 + 0.008 1.164 ± 0.006 1.337 + 0.008 1.225 ± 0.015 1.405 ± 0.016 0.22 + 0.014 0.229 + 0.014 0.227 + 0.015 1.176 + 0.012 1.311 + 0.012 0.893 + 0.014
1.7 х КГ7 53 0.954 + 0.02 1.112 ± 0.007 0.897 + 0.017 1.172 ± 0.029 0.205 + 0.008 0.209 + 0.017 1.212 + 0.013 1.113 + 0.013 0.621 ± 0.013 0.327 ± 0.011 1.02 ± 0.015 1.155 + 0.017
4.7 х Ю~8 58 0.491 + 0.004 0.863 + 0.01 0.556 ± 0.011 1.375 ± 0.018 0.279 + 0.018 1.257 ± 0.018 0.271 ± 0.018 0.2 + 0.009 0.529 + 0.022 0.209 + 0.025 0.737 + 0.016 1.223 ± 0.012
1.7 х КГ10 64 1.411 + 0.005 1.163 + 0.01 1.355 + 0.008 1.391 +0.022 1.375 + 0.024 1.333 ± 0.016 0.211 + 0.015 - 0.297 ± 0.011 1.412 ± 0.012 0.669 + 0.014 1.432 + 0.016
3.2 х КГ8 67 1.112 + 0.011 0.848 + 0.018 1.159 + 0.01 0.534 + 0.017 0.521 + 0.02 0.565 ± 0.011 0.222 + 0.02 0.407 + 0.013 0.193 ± 0.013 1.021 ± 0.022 1.139 + 0.018 1.304 + 0.023
8.5 х Ю~9 102 0.212 + 0.008 0.555 ± 0.012 0.633 + 0.022 0.292 + 0.016 0.315 ± 0.012 0.218 + 0.005 1.334 ± 0.01 0.221 +0.022 - 0.519 ± 0.018 0.256 + 0.022 0.213 ± 0.014
6.1 х КГ7 173 0.328 + 0.005 0.215 + 0.002 0.432 + 0.01 1.257 + 0.011 1.025 ± 0.018 1.432 ± 0.021 1.20
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.