научная статья по теме НОВЫЙ РЕАГЕНТ ДЛЯ ФОСФАМИДИТНОГО СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, МЕЧЕННЫХ БИОТИНОМ Химия

Текст научной статьи на тему «НОВЫЙ РЕАГЕНТ ДЛЯ ФОСФАМИДИТНОГО СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, МЕЧЕННЫХ БИОТИНОМ»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ

Том 19 *

ХИМИЯ

№ 1 * 1993

УДК 577.113.6

© 1993 В. А. Коршун, Е. В. Ножевникова, Ю. А. Берлин

НОВЫЙ РЕАГЕНТ ДЛЯ ФОСФАМИДИТНОГО СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, МЕЧЕННЫХ БИОТИНОМ

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН, Москва

Биотин, благодаря уникальной способности образовывать чрезвычайно устойчивые комплексы со стрептавидином и родственными белками, находит многообразное применение в качестве нерадиоактивной метки при изучении различных биохимических процессов [1 ]. Особенно широко используются меченные биотином олиго- и полинуклеотиды [2], являющиеся эффективными инструментами мо-лекулярно-биологических исследований и медико-генетической диагностики [3 ].

Остатки биотина могут быть введены в различные положения молекулы олигонуклеотида прямым ацилированием по модифицирующим алифатическим аминогруппам [4 ] или же в ходе синтеза (биохимического или чисто химического) — с использованием в качестве одного из предшественников (т. е. мономерных звеньев) биотинсодержащего 5'-трифосфата нуклеозида [5] или нуклеозидного З'-фосфамидита [6, 7].

Чтобы уменьшить вероятность влияния биотинсодержащих остатков на гибридизационные свойства олигонуклеотида, в ряде случаев представляется целесообразным, не затрагивая оснований, вводить остаток биотина не в промежуточное, а в концевое положение цепи. Концевую модификацию олигонуклеотида (чаще речь идет о 5'-положении, что сохраняет для нуклеотидной цепи возможность ферментативной элонгации) удобно осуществлять с помощью ненуклеотидного реагента, содержащего как биотиновый остаток, так и фос-форилирующую группировку [8—11 ]. Синтез ранее описанных реагентов такого рода довольно громоздок. В настоящем сообщении представлен простой синтез нового биотинилирующего реагента для фосфамидитного олигонуклеотидного синтеза.

Исходным соединением явился диэтаноламин (I), в котором гидроксилы моделируют 5',3'-диольную группировку дезоксинуклеозида, а азот служит якорным атомом для введения остатка биотина в молекулу будущего реагента (см. схему). По этому азоту диэтаноламин был ацилирован в пиридине эквимольным количеством активированного (пентафторфенилового) эфира 6-аминокапроновой кислоты, чья собственная аминогруппа была предварительно защищена флуоренил-метоксикарбонильным (Fmoc) остатком. Продукт N-ацилирования (II) удобно не выделять, а обрабатывать DMT-C1 прямо в реакционном растворе. Получающаяся смесь соединений (II—IV) легко разделяется колоночной хроматографией на силикагеле, причем целевое моноаралкильное производное (III) используется на следующей стадии, а соединения (II) и (IV) могут быть снова превращены

Используемые сокращения: Fmoc — (9-флуоренил)метоксикарбонил; DMT — 4,4' -диметоксигри-

Т ИЛ.

OH OR2

a) C6F5OCO(CH2)5NHFmoc/impiiHMH; 6) DMT-Cl/пиридин; в) iPr2NH/MeCN; г) пентафторфениловый эфир (+)-биотина/пиридин; д) (iPr2N)2POCH2CH2CN (VIII)/ тетраэолид диизопропиламмония/MeCN

в исходную смесь соответственно повторной обработкой DMT-C1 в пиридине и действием эквивалентного количества трифторуксусной кислоты в хлороформе.

После удаления из соединения (III) защитной Fmoc-группы полученный амин (V) был проацилирован пентафторфениловым эфиром биотина в пиридине с образованием спирта (VI). Его фосфитилирование бис (N, N-диизопропиламино)-2-цианэтоксифосфином (VIII) привело к конечному амидиту — 0'-(4,4'-диметок-ситритил) -О5- (N, К-диизопропиламино-2-цианэтоксифосфинил) -3- (N-биотинил-6-аминокапроил)-3-аза-1,5-пентандиолу (VII), который был выделен колоночной хроматографией на силикагеле и переосажден из толуола гексаном. ТСХ: Rf 0,26 (ацетон — триэтиламин, 9:1, пластинка Kieselgel 60 F25i, Merck). Масс-спектр (времяпролетный масс-спектрометр МСБХ с ионизацией осколками деления 252Cf, ПО «Электрон», Сумы, Украина), (m/z)+: 969,8 (M + Na), вычислено для (Ci0H7lN6OgPS + Na) 970,2. 'Н-ЯМР-спектр (спектрометр Bruker АС-500 (500 МГц); CDC13; <5, м. д.): 7,4—7,2, 6,9—6,8 (м, 13Н, Ar Я); 6,24, 6,33 (2 уш. е., 2Н, NHCONH); 5,49 (уш. с, 1Н, CH2N#); 4,46 (м, 1Н), 4,28 (м, 1Н, C//NHC0NHC/0; 3,85—3,5, 3,3—3,2 (м, 20Н, СЯ2ОРОСЯ2СЯ21ЧСЯ2СЯ2, ОСЯ3 (3,79), СЯСН3, СЯ2КН); 3,13 (м, 1Н, С HS); 2,87 (м, 1Н), 2,71 (м, 1Н, СЯ2 S); 2,61 (м, 2Н, СЯ2СЫ); 2,38 (м, 2Н), 2,18 (м, 2Н, 2СЯ2СО); 1,8—1,2 (м, 12Н, СЯ2СЯ2СЯ2СН2ЫНСОСН2СЯ2СЯ2СЯ2); 1,17 (м, 12Н, СНСЯ3).

Таким образом, фосфитилирующий реагент (VIII) получен из доступных

исходных веществ посредством довольно простой последовательности гладко протекающих реакций. Реагент, хорошо растворимый в ацетонитриле, не требует специальных условий конденсации и может быть использован в автоматическом синтезаторе подобно стандартным нуклеозидфосфамидитным синтонам. Этот реагент позволяет вводить один или несколько биотиновых остатков в олигонуклеотиды (в том числе по 5'-концу), причем количество метки, введенной на каждой стадии, можно контролировать по поглощению катиона DMT+, Поскольку в основе реагента лежит нехиральная и даже непрохиральная псевдосахарная единица (на основе диэтаноламина 112]), исключается образование диастереомеров и, следовательно, потенциальная гетерогенность гибридизацион-ных свойств модифицированных олигонуклеотидов; аминокапроильный спейсер обеспечивает дополнительную стерическую свободу авидин(стрептавидин)-биотиновых взаимодействий.

Авторы благодарны Т. А. Балашовой за регистрацию 'Н-ЯМР-спектра, Ю. П. Козьмину за регистрацию масс-спектра, М. С. Щепинову и Д. А. Стеценко за полезное обсуждение.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Avidin-Biolin Technology/Eds Bayer Е. A., Wilchek M.//Meth. Enzymol. 1990. V. 184.

2. Goodchild /.//Bioconjugate Chem. 1990. V. 1. № 3. P. 165—187.

3. Saiki R. 1С, Walsh P. S., Levenson С. H., Ehrlich H. A//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86.

№ 16. P. 6230—6234.

4. Telser J., Cruickshank K. A., Morrison L. E., Netzel T. L.//1. Amer. Chem. Soc. 1989. V. 111.

№ 18. P. 6966—6976.

5. Rigas В., Welcher A. A., Ward D. C., Weissman S. М.ЦProc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83.

№ 24. P. 9591—9595.

6. Roget Л , Baiin #., Teoule R.I I Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. № 19. P. 7643—7651.

7. Pieles V., Sproat B. S., Lamm G. M.I I Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. № 15. P. 4355—4360.

8. Alices A. M., Holland IX, Edge M. D.//Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. № 23. P. 3089—3092.

9. Cocuzza A. J.!/Tetrahedron Lett 1989. V. 30. № 46. P. 6287—6290.

10. Pon R. T.//Tetrahedron Lett. 1991. V. 32. № 14. P. 1715—1718.

11. Misiura K, Durrani I., Evans M. R., Gait M. /.//Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. № 15. P. 4345—4354.

12. Lin K.-Y., Matteucci M.I I Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. № 11. P. 3111—3114.

Поступило- в редакцию 24.IX.1992

V. A. KORSHUN, E. V. NOZHEVNIKOVA, Yu. A. BERLIN

A NOVEL REAGENT FOR PHOSPHORAMID1TE SYNTHESIS OF BIOTIN-LABELLED OLIGONUCLEOTIDES

M. M. Shemyakin institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow

A novel phosphitylating reagent, o'-(4,4'-dimethoxytrityl)-05-(N,N-diisopropylamino-2-cyanoethoxyphosphinyl)-3-(N-biotinyl-6-aminocaproyl)-3-aza-l,5-pentanedioI (VII), has been synthesized. The reagent can be used in the standard DNA synthesis to prepare oligonucleotides terminally labelled with biotin residue (s).

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком