rm.« БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 3, с. 380-382
ш
ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 577.15.08
НОВЫЙ ВОДОРАСТВОРИМЫЙ СУБСТРАТ ДЛЯ СИЛИКАТЕИНОВ
© 2015 г. Н. В. Поварова*, М. С. Баранов*, С. Н. Ковальчук**, И. В. Семилетова**,
К. А. Лукьянов*, ***, #, В. Б. Кожемяко**, ##
*Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН, 690022 Владивосток, пр-т 100лет Владивостоку, 159 ***Научно-исследовательский институт биомедицинских технологий Нижегородской государственной медицинской академии, 603005, Нижний Новгород, пл. Минина, 10/1 Поступила в редакцию 01.12.2014 г. Принята к печати 20.12.2014 г.
Предложено использование тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликата (THEOS) в качестве субстрата для силикатеинов — семейства ферментов, играющих ключевую роль в формировании скелета губок. Проведено сравнение THEOS и широко применяемого в настоящее время субстрата силикатеинов — тетраэтоксиортосиликата (TEOS) в реакции образования аморфного кремнезема in vitro си-ликатеином А1 губки Latrunculia oparinae. Показано, что реакция с THEOS протекает значительно эффективнее, чем с TEOS, вероятно, благодаря высокой растворимости в воде и более высокой скорости гидролиза THEOS.
Ключевые слова: силикатеин, кремнезем, тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликат, тетраэтоксиор-тосиликат.
DOI: 10.7868/S0132342315030070
Первый силикатеин был описан в 1998 г. [1]. В природе эти белки участвуют в формировании кремниевого скелета обыкновенных губок (Demosongia). Естественным субстратом силикатеинов, по-видимому, является кремниевая кислота, присутствующая в морской воде в микромолярных концентрациях [2]. Из-за неудобства работы с кремниевой кислотой, в первых же исследованиях силикатеинов in vitro было предложено использовать прегидроли-зованный тетраэтоксиортосиликат (TEOS) в качестве источника силикат-ионов [3]. Предварительный гидролиз необходим, так как TEOS практически не растворим в воде и при смешивании с водой образует эмульсию, а при добавлении кислоты — частично гидролизуется и переходит в водную фазу. Позже в качестве субстрата некоторые исследователи стали применять трис(катехол)ортосиликат калия [4]. Это соединение растворимо в воде, однако его водные растворы нестабильны. Трис(катехол)ор-тосиликат калия значительно дороже, чем TEOS, кроме того, он токсичен для человека.
Сокращения: THEOS — тетракис(2-гидроксиэтил)ортоси-ликат; TEOS — тетраэтоксиортосиликат.
#Автор для связи (тел.: +7(499) 742-81-22, эл. почта: kluk@ibch.ru).
##Автор для связи (тел.: +7 (423) 231-07-03, эл. почта: kozhemyako@gmail.com).
В настоящее время силикатеины активно используют для разработки новых методов и материалов для нанотехнологии и биомедицины, например, энзиматической иммобилизации белков, регенерации костной ткани, формирования наночастиц и др. [5—7]. Использование нового субстрата может упростить развитие этих технологий.
В настоящей работе мы проверили возможность использования тетракис(2-гидроксиэтил)ортоси-ликата (THEOS) в качестве субстрата для силикатеинов. THEOS при комнатной температуре является жидкостью и хорошо растворяется в воде, что потенциально делает его наиболее удобным среди всех вышеупомянутых кремниевых субстратов.
Синтез THEOS проводили, как описано ранее [8]. К смеси тетраэтоксисилана (10.4 г, 0.05 моль) и этиленгликоля (12.4 г, 0.2 моль) добавляли катионообменную смолу DOWEX 50 WX 8 (Н+-форма, 100 мг) и перемешивали при температуре 90°C в течение 10 ч. Полученную смесь отфильтровывали и сушили на роторном испарителе от остаточных количеств этилового спирта. Полученную бесцветную маслянистую жидкость (12.5 г, выход 92%) использовали в дальнейших экспериментах без дополнительной очистки.
В работе использовали силикатеин А1 морской губки Latrunculia oparinae, описанный ранее [9]. Его зрелая форма (после отщепления лидерного пепти-
да) образована 218 а.о. и имеет 77% гомологии с а-изоформой силикатеина губки Suberites do-muncula, одним из наиболее изученных белков семейства [10]. Фрагмент, кодирующий зрелую форму силикатеина А1, был амплифицирован на матрице кДНК, полученной на основе РНК губки L. oparinae в ходе работы по исследованию разнообразия ее силикатеинов [9]. Этот фрагмент был клонирован в вектор pET-40b(+) так, что ре-комбинантный белок на С-конце имел шестиги-стидиновую последовательность. Полученная конструкция была экспрессирована в клетках E. coli (штамм BL21-CodonPlus). Экспрессию индуцировали изопропил^^-1-тиогалактопира-нозидом (IPTG, 0.1 мМ) в течение ночи при 37°C, силикатеин выделяли с помощью металл-аффинной хроматографии с носителем Ni Sepharose Excel (GE Healthcare Life Sciences) в буфере 20 мМ Tris-HCl, 5 мМ DTT, pH 7.25. Элюированный белок перед анализом переводили в 20 мМ Tris-HCl pH 7.25 с использованием колонок PD-10 (GE Healthcare Life Sciences).
Предварительный гидролиз TEOS проводили при добавлении 50 мМ HCl в течение 30 мин при комнатной температуре. Концентрация TEOS в эмульсии составляла 250 мМ. Раствор THEOS готовили путем разбавления THEOS буфером Tris-HCl рН 7.25 до концентрации 250 мМ.
Реакцию с очищенным силикатеином А1 (0.15 мг/мл) проводили при 37°С в буферном растворе 20 мМ Tris-HCl рН 7.25 в течении 1 ч в присутствии субстратов в концентрациях 1, 5 или 10 мМ. Об эффективности реакции образования микрочастиц SiO2 судили по помутнению раствора (возрастанию оптической плотности при 600 нм из-за светорассеяния). Как видно на рисунке, THEOS обеспечивал существенно более высокую активность силикатеина А1, чем TEOS. Анализ контрольных образцов субстратов в тех же условиях, но без добавления силикатеина показал, что TEOS значительно стабильнее, чем THEOS. Учитывая тот факт, что в природе субстратом силикатеинов является кремниевая кислота, при использовании TEOS и THEOS настоящим субстратом является не исходная молекула, а продукты ее гидролиза. Следовательно, более высокая скорость гидролиза THEOS в данных условиях может быть основной причиной повышенной активности фермента при использовании THEOS в качестве субстрата.
Таким образом, можно заключить, что как по эффективности реакции с силикатеином in vitro, так и по удобству использования (вследствие высокой растворимости и отсутствия стадии предварительного гидролиза) THEOS предпочтительнее широко используемого в настоящее время субстрата TEOS.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа поддержана грантом РНФ 14-25-00129.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 41 № 3 2015
381
0.6
8 0.5
о о
g 0.3
о ч с
£ 0.2
к 0.1 н С О
0
THEOS TEOS THEOS TEOS
+
Силикатеин А1
Сравнение THEOS и TEOS в качестве субстратов для силикатеина А1. Гистограмма показывает оптическую плотность при 600 нм растворов THEOS и TEOS концентрацией 1, 5 или 10 мМ (светло-серые, серые и темно-серые столбцы соответственно) после инкубации в присутствии (слева) или в отсутствие (справа) силикатина А1. Показаны средние значения и стандартные отклонения по результатам трех экспериментов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Shimizu K, Cha J., Stucky G.D., Morse D.E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 6234-6238.
2. Belton DJ, Deschaume O, Perry C.C. // FEBS J. 2012. V. 279. P. 1710-1720.
3. Cha J.N., Shimizu K, Zhou Y, Christiansen S.C., Chmelka B.F, Stucky G.D, Morse D.E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 361-365.
4. Belton D, Paine G., Patwardhan S.V., Perry С.С. // J. Mater. Chem. 2004. V. 14. P. 2231-2241.
5. Schröder H.C., Schlossmacher U, Boreiko A., Natalio F., Baranowska M., Brandt D, Wang X., Tremel W., Wiens M, Müller W.E. // Prog. Mol. Subcell. Biol. 2009. V. 47. P. 251-273.
6. Ki M.R., Yeo K.B., Pack S.P. // Bioprocess. Biosyst. Eng. 2013. V. 36. P. 643-648.
7. WangS., WangX., DraenertF.G., AlbertO., SchröderH.C., Mailänder V., Mitov G, Müller W.E. // Bone. 2014. V. 67. P. 292-304.
8. Ishikawa Y., Sakamoto K., Seki T., Yajima I., Taka-hashi S., Watanabe K. // Patent EP1930337 A1, 2008.
9. Kozhemyako V.B., Veremeichik G.N., Shkryl Y.N., Ko-valchuk S.N., Krasokhin V.B., Rasskazov V.A., Zhuravlev Y.N., Bulgakov V.P., Kulchin Y.N. // Mar. Biotechnol. (NY). 2010. V. 12. P. 403-409.
10. Müller W.E., Boreiko A., WangX., Belikov S.I., Wiens M., Grebenjuk V.A., Schlossmacher U., Schröder H.C. // Gene. 2007. V. 395. P. 62-71.
НОВЫЙ водорастворимыи субстрат для силикатеинов
Г*1
I-1 1 мМ
I-1 5 мМ
□ 10 мМ
■
382
ПОВАРОВА и др.
Novel Water-Soluble Substrate for Silicateins
N. V. Povarova*, M. S. Baranov*, S. N. Kovalchuk**, I. V. Semiletova**, K. A. Lukyanov#, *, ***, V. B. Kozhemyako##, **
#Phone: +7(499) 742-81-22, e-mail: kluk@ibch.ru ##Phone: +7(423) 231-07-03, e-mail: kozhemyako@gmail.com *Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997Russia **Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, prospect 100 let Vladivostoku 159, Vladivostok,690022 Russia ***Institute of Biomedical Technologies, Nizhny Novgorod State Medical Academy, pl. Minina, 10/1, Nizhny Novgorod, 603005 Russia
We suggested to use tetrakis(2-hydroxyethyl)orthosilicate (THEOS) as a substrate for silicateins—an enzyme family playing a key role in formation of skeleton in marine sponges. We compared THEOS with tetraethy-lorthosilicate (TEOS)—a commonly used substrate for silicateins. These substrates were tested in reaction of amorphous silica formation in vitro catalyzed by silicatein A1 from sponge Latrunculia oparinae. It was found that reaction with THEOS occurs more efficiently than with TEOS, probably due to high water solubility and higher hydrolysis rate of THEOS.
Keywords: silicatein, silica, tetrakis(2-hydroxyethyl)orthosilicate, tetraethylorthosilicate
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 41
№ 3 2015
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.