УДК 577.152.31*302.088.5
НУ К ЛЕ АЗЫ Serratia marcescens. IIй. АНАЛИЗ ПЕРВИЧНЫХ СТРУКТУР ПУТЕМ ПЕПТИДНОГО КАРТИРОВАНИЯ В КОМБИНАЦИИ С ПЛАЗМЕННО-ДЕСОРБЦИОННОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЕЙ
© 1995 г. Ю. Педерсен, М. Н. Филимонова*, П. Роепсторф**, К. Бидерман
Кафедра биотехнологии Датского технического университета, г. Лингби; * Кафедра микробиологии Казанского государственного университета, 420008, Казань, ул. Ленина, 18; ** Кафедра молекулярной биологии Университета г. Оденсе Поступила в редакцию 21.04.94 г. После доработки 26.08.94 г.
Плазменно-десорбционттой масс-спектрометрией (ПДМС) протеолитических пептидов, выделенных обращенно-фазовой ВЭЖХ, полностью охарактеризованы первичные структуры нуклеаз Sm 1, Sm2, Sm3, продуцируемых бактерией Serratia marcescens. Изоформы разделяли анионообменной хроматографией на колонке с: DEAE-целлюлозой и подвергали гидролизу лизинспецифичной эндо-лротеиназоп Lys-C. Сравнительный анализ пептидов, идентифицированных ПДМС, показал, что все три нуклеазы являются \!-концевыми вариантами одного и того же белка: Sm2 представляет собой "зрелую" форму белка, в Sm 1 и Sm3 отсутствуют 3 и 1 N-концевые аминокислоты соответственно.
Ключевые слова: изоформы ферментов; белки, структура первичная; масс-спектрометрия плаз-менно-десорбционная, Serratia marcescens.
Начиная с 60-х годов внеклеточная нуклеаза Serratia marcescens (КФ 3.1.30.2), гидролизующая как ДНК, так и РНК с образованием нуклеотидов низкой степени полимерности, является объектом различного рода исследований. Определена полная нуклеотидная последовательность гена нуклеазы с последующим rij сведением его клонирования и экспрессии в клетках S. marcescens и Е. coli [2-6]. Подробно изучены физико-химические и биохимические свойства фермента [4, 7 - 12]. Проведен первичным кристаллографический анализ нуклеазы S. marcescens [13, 14],
Поскольку препарат эндонуклеазы S. marcescens, секретирующийся различными штаммами бактерий, содержит по меньшей мере две изоформы [9, 11, 12, 1 5, 16], целью настоящей работы является проведение сравнительного анализа первичных структур изоформ. Поставленная цель была достигнута путем пептидного картирования изофермептов в комбинации с плазменно-десорбционной масс-спектрометрией пептидов.
11репараты эндонуклеазы выделяли из куль-туральных жидкостей, полученных в результате проведения двух отдельных ферментаций S. marcescens В1 ОМ 1 с использованием описанной ранее
11 Сообщение I см. [ 1 ]. Использованные сокращения: ПДМС - плазменно-десорб-ционная масс-спектрометрия, TFA - трифторуксусная кислота.
процедуры, в основе которой лежит трехстадий-ная очистка с применением ионообменной хроматографии на DEAE- и фосфоцеллюлозе [ 10]. Полученные препараты разделяли на изоформы анионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе DE-52 (Whatman) с элюцией в линейном градиенте рН (8.25 - 7.20) 50 мМ трис-НС1-буфера [12].
Изоэлектрическое фокусирование выделенных изоформ показало, что из сульфат-аммониевой фракции одной из фермент,зипи вместе с
рН
9.5 г—
7.4М W
7.0 —
5.9 г-
5.2
i J- -
4 3 2 ]
Рис. 1. Изоэлектрофокусирование изоформ нуклеазы в агарозном геле. 1 - Sm 1; 2 - Sm2\ 3 - Sml/Sm2; 4 - маркерные белки.
Рие. 2. Фракционирование пептидов, полученных протеолизом изоформ Sm2 (а) и смеси Sml и Sm3 (б) нуклеазы S. marcescens В10М1 эндопротеиназой Lys-C, обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке (4.6 х 250 мм) с нуклеосилом С18. Образцы наносили в буфере А, содержащем 0.1% TFA; пептиды элюировали градиентом концентрации буфера В (ацетонитрил, 0 - 48%) в 0.1 % TFA со скоростью 1 мл/мин.
изоформой 5т 1 выделялась ранее не охарактеризованная нуклеаза, имеющая изоэлектрическую точку (рI) 7.3, отличную от изоэлектрических точек двух известных нуклеаз - 5т 1 и 5т2 (р/ 7.4 и 6.8 соответственно [12, 17]) (рис. 1). Изоформа была названа 5тЗ и подвергнута структурному анализу параллельно с нуклеазами 5т2 и 5т 1.
Первый этап характеристики трех изофер-ментов - разделение продуктов протеолиза эндопротеиназой Ьув-С, специфичной к пептидной связи Ьув-Хаа [18], обращенно-фазовой ВЭЖХ -выявил некоторые различия в пептидных картах изоформ. Так, пики 22 и 9 (рис. 2а), заметные в хроматограмме 5т2 , отсутствовали в хромато-графическом профиле смеси изоформ 5т2 и 5тЗ
(5т1/5тЗ) (рис. 26). Напротив, пики 7, 3, 7 и 8 и первое плечо пика 19 хроматограммы 5т1/5тЗ не были выявлены для изоформы 5т2. Хромато-графический профиль пептидов 5т 1 отдельно не показан, поскольку он идентичен хроматограмме 5т1/5тЗ (за исключением небольших отличий в высоте пиков).
Последующий анализ пептидов с помощью ПДМС подтвердил предполагаемые различия изоформ (рис. 3, таблица). Так, пептид пика 22 нуклеазы 5т2 с молекулярной массой 3837.5 полностью отсутствовал в гидролизатах 5т 1 и 5т1/5тЗ и по массе соответствовал Ы-концевому пептиду Авр'-Ьуз37. Вместо этого в гидролизатах 5т 1 и в меньшей степени 5т1/5тЗ был выявлен другой
Рис. 26.
пептид, дававший значительное плечо в пике 19 и имевший молекулярную массу 3508.4. Данный пептид соответствовал фрагменту Glu4-Lys37, рассчитанному для N-концевого пептида, и свидетельствовал в пользу структурных различий изоформ 5m 1 и 5т 2. Кроме того, для вещества пика 20, представленного на хроматограмме 5ml/5m3, был определен молекулярный ион с m/z 3721.8, соответствовавший иному варианту N-концевого пептида - Thr2-Lys37. Подобный ион отсутствовал в масс-спектре пептидов пика с аналогичным временем элюции при хроматографии гидролизата нуклеазы Sm2. Вместо него был найден молекулярный ион с m/z 2494.0, соответствующий другому варианту N-концевого пептида - Asp'-Arg25, полученному, очевидно, в результате неспецифического расщепления по Arg25 с С-конца. Ни один
из этих двух молекулярных ионов не был найден для пика 20 хроматограммы 5т 1; вместо них был обнаружен ион с т/г 2206.7, предварительно соотнесенный с последовательностью Уа185-Ьеи105, выявленный также для вещества пика 20 изофор-мы 5т2. Таким образом, изофермент 5т 3 отличался по структуре как от 5т 1-, так и от 5т2-изоформ.
Однако наряду с выявленными различиями проведенный анализ показал, что большинство пептидов, идентифицированных для нуклеазы 5т2, присутствовало в продуктах протеолиза изоформ 5т 1 и смеси изоформ 5т1/5тЗ.
Многие из продуктов минорных пиков на представленных хроматограммах, так же как и компоненты, элюированные вместе с основными пептидами в больших пиках, были идентифицированы как фрагменты неспецифического гидролиза.
НУКЛЕАЗЫ БеггаНа тагсезсепя
339
Молекулярные массы пептидов из гидролизатов нуклеаз 5т2, 8т\ и смеси БтЦБтЗ, определенные с помощью ПДМС. (Для сравнения представлены рассчитанные на основании аминокислотной последовательности молекулярные массы ожидавшихся пептидов)
Номер пика при вэжх Участок нуклеазы Молекулярная масса пептида
Рассчитанная Измеренная для гидролизата
5/гг2 БтМЗтЪ 5т 1
22 1 - 37 3838.1ь 3837.5
20 1 - 25 2492.7 а Ь 2494.0
20 2-37 3723. Г''ь 3721.8
19 4-37 3508.8а-ь 3508.5 3508.4
18 4-25 2163.4а'ь 2163.5 2163.8
10 26-37 1363.5а 1363.4 1363.7 1362.5
24 38-48 1349.6 1350.3 1349.7 1349.7
18 40-48 1131.За 1132.3
4 45-48 497.9а 498.4 498.4 498.4
2 49-55 674.7 675.3 675.4 675.4
9 56-60 703.8 704.6
21 61 - 84 2171.6 2371.5 2371.0 3271.6
2 85 - 90 710.8а 711.5 711.5
20 85 - 105 2208.4а 2206.6 2206.7
31 85 - 115 3367.7 3368.0 3367.3 3366.3
10 107- 115 1063.2а 1064.3 1063.4 1064.0
19 116- 132 2016.2 2016.1 2016.0 2016.4
20 133 - 143 1251.4а 1252.3 1252.2
25 133- 156 2700.1 2699.5 2699.2 2699.0
6 157 - 162 642.8 643.6 643.4 643.6
7 153 - 162 1073.3а 1073.3 1072.9
18 163 - 172 1173.3 1174.3
5 171-172 332.4а 333.2 333.1 333.1
13 163 - 170 859.0а 859.4 859.6 859.9
8 163 - 168 624.7а 625.7 625.3
18 173 - 184 1324.5а 1325.3 1325.2 1325.0
30 173 - 196 2721.1 2720.8 2720.0 2720.7
29 197-212 1856.1ь 1856.4 1856.6 1857.1
13 205 -213 1088.2а 1089.3 1089.2 1088.9
31 213-231 232 - 233 2053.4 233.3 2053.6 2053.2 2053.1
29 234 - 244 197-212 1142.4Ь 1142.9 1143.2 1142.4
29 234 - 244 197-212 2996.5 2998.1 2998.4 2997.2
27 232 - 244 245 3212.0 132.1 3213.7 3213.5 3212.9
а Пептиды неспецифического гидролиза.
ь Расчеты производились на основании предположения существования свободной 5Н-группы.
10 20 Н-Ав р-Т11 г-Ьеи-в! и -Эе г - ] 1 е -А ер-Азп-Суэ - А1 а -Уа 1-01 у-Сув-Рго - ТИ г-О! у-в 1 у - 5е г-5 е г-А эп-
30 —40
Уа I -5е г - Пе-Уа1 -А^-Ш в-А! а-Ту г-ТЬ г-Ьей-Авп-Ав п- Ав п-Я е г-ТЬ г -ТЬ г-Ьу Б-РЬе-А! а-Аяп-
50 60
Тгр-Уа1-А1 а-Т уг-Н1 в - IIе-ТЬг-Ьув-Аяр-ТЬг-Рго-А1а-8ег-01у-Ьу в-ТЬг-А ^-Аэ п-Т г р-Ьу э -
70 80
Т Ь г-Ав р - Рго-А1а-Ьеи-Ав п-Рг о-А1 а-Азр-ТЬг-Ьеи-А1 а- Р г о-А1а-Аб р-Туг-ТЬ г-О 1у-А1а-Авп-
90 100
А1 а-А1 а-Ьеи-Ьув-Уа! -Лвр-А^-в! у-Ш я-01 п~А1 а -Р г о-Ь е и-А1 а-Э е г-Ье и-А1 а-С1у-Уа1 -Б ег-
110 120 А8р-Тгр-01и-5ег-Ьеи-А8П-Ту г-Ьей- 5ег-А8п-11е-ТЬг-Рго-01п-Ьу5-8ег-Аяр-Ьеи-А8п-С1п-
130 140
01у-А1а-Тгр-А1а-А^-Ьеи~01 и-Аэр-О! п-в! и-А^-Ь у в- Ьей- I 1 е-Ав р-Аг g-A 1 а-А я р— I 1 е - Б е г -
150 160
Б е г-Уа 1 -Ту г-ТЬг-Уа 1 -ТИ г -в 1 у-Рго-Ье и-Ту г-01 и-Аг g- А в р-Ме 1-0 1 у-Ьуэ-Ьеи- Рго-в 1 у-ТЬг-
170 180
О 1 п - Ь у Э - АI а -Н 1 э -Т11 г - I 1 е-Р го-Б е г-А1 а -Ту г -Т г р-Ьув- У а 1 -I 1 е-РЬе-11 е-А 8 п-Ав п-Б ег-Рго-
190 200
А 1 а - Уа I - А зп-Н1в-Ту г-А1а-А1а-РЬе-Ь еи-Р Ье-Авр-О! п-Аэ р-ТЬг-Рго-Ьуб-Оу-А1 а-А вр-РЬе-
21 0 ' 220 Су ,ч — 01 п-РЬе-А ^-Уа 1 -ТЬг-Уа 1 -Аэр-О! и - I 1 е-01 и-Ьув- Arg-Th г-в! у-Ьеи- I 1 е- 11 е-Т гр-А1 а-
23 0 240
01 у-Ье и- Рго-Аэ р-А эр-У а I -О 1п-А1а-5ег-Ьеи-Ьуз-8ег-Ьу8-Р го-01 у-Уа I - Ьеи-Р г о- О 1 и-Ьеи-
Ме I -01 и - Су я-Ь уэ - А вп-ОН
Гис. 3. Аминокислотная последовательность изоформ нуклеазы тагсезсет, определенная методом плазменно-де-сорбционной масс-спектрометрии их протеолитических пептидов. Обозначения пептидов изоформ 5. тагсеясепа В10М1: / - образовавшиеся в результате специфического гидролиза эндопротсиназой Ьуз-С изоформ 8т2 , 5т1/5тЗ и Ят 1; 2 - образовавшиеся в результате неспецифического гидролиза изоформ , и 5/н1; 3 - выявленные
только в нуклеазе 5т2 ; 4 - найденны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.