w
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 5, с. 330 - 335
УДК 577.152.31*302.088.5
НУКЛЕАЗЫ Serratia marcescens. I. СРАВНЕНИЕ ПРИРОДНОЙ И РЕКОМБИНАНТНОЙ НУКЛЕАЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОСПРЕЙ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
© 1995 г. Ю. Педерсен, Ж. Андерсен*, П. Роепсторф*, М. Н. Филимонова**, К. Бидерман
Кафедра биотехнологии Датского технического университета, г. Лингби * Кафедра молекулярной биологии Университета г. Оденсе ** Кафедра микробиологии Казанского государственного университета Поступила в редакцию 26.05.94 г. После доработки 26.08.94 г.
Охарактеризованы по молекулярной массе, определенной электроспрей-масс-спектрометрией, изоформы природной и рекомбинантной нуклеаз Serratia marcescens. Природную нуклеазу выделяли из культуральной жидкости бактерии S. marcescens В1 ОМ 1, рекомбинантную получали в результате культивирования клеток Escherichia coli МТ102, несущих плазмиду p403-SD2 с геном нуклеазы пне. Первичная структура каждой из изоформ, выделенных из препаратов нуклеаз, была установлена путем сопоставления их молекулярных масс с известной аминокислотной последовательностью, являющейся производной от нуклеотидной последовательности гена пис. Установлено, что оба препарата включали одинаковые варианты нуклеазы с отщеплениями в области N-конца. Однако количество изоформ в природной нуклеазе было значительно больше, чем в рекомбинантной. Структура некоторых изоформ была подтверждена N-концевым анализом.
Ключевые слова: нуклеаза; изоформы фермента; электроспрей-масс-спектрометрия; молекулярная масса; Serratia marcescens, Escherichia coli.
Внеклеточная нуклеаза Serratia marcescens (эндонуклеаза, КФ 3.1.30.2), ранее классифицированная как дезоксирибонуклеат (рибонукле-ат)-5'-нуклеотидогидролаза [1], секретируется в окружающую среду как природными, так и ре-комбинантными штаммами бактерии [1 -4]. Фермент также может быть синтезирован клетками Е. coli в случае клонирования и экспрессии в них структурного гена нуклеазы S. marcescens [5, 6]. Показано, что и природная, и рекомбинантная нуклеазы представлены несколькими изоформа-ми, различающимися изоэлектрическими точками [7 - 9]. Две изоформы - Sml (р/ 7.4) и Sm2 (р/ 6.8) - были выделены из культуральной жидкости S. marcescens В10М1 и частично охарактеризованы [8, 9]. Установлено высокое сходство их структур и различие в области N-конца. Изофор-ма, близкая по изоэлектрической точке (р/ 6.9) к Sm2, также обнаружена как доминирующий компонент в препарате рекомбинантной нуклеазы. Подробно изучены ее свойства [5]. Кроме того, выявлено большое количество вариантов рекомбинантной нуклеазы с р/ от 4.5 до 8.0 [7]. Однако сравнительный анализ изоформ природной и рекомбинантной нуклеаз до сих пор никем не проводился, поскольку все попытки выделить и охарактеризовать некоторые варианты рекомбинантной
нуклеазы оказывались безуспешными из-за малых количеств вещества. В связи с этим метод эле-ктроспрей-масс-спектрометрии (ЭСМС), позволяющий быстро проводить анализ масс иико-мольных количеств белков с точностью до 0.01% при молекулярной массе (МГ), не превышающей 150000 [10], представлялся весьма перспективным для подобного исследования. С одной стороны, он позволял быстро и точно охарактеризовать изоформы нуклеаз по молекулярным массам, с другой - провести сравнительный анализ по молекулярным массам изоформ природного и ре-комбинантного белков. Результаты, полученные при решении этих задач, описаны ниже.
Прежде всего препараты природной и рекомбинантной нуклеаз, полученные ионообменной хроматографией на DEAE- и фосфоцеллюлозе Р-11 [11], подвергали первичному разделению на изоформы анионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе DE-52 (Whatman) [9]. В результате каждый из препаратов нуклеаз был разделен на две большие фракции. В природной нуклеазе обе фракции содержались примерно в равных количествах и были элюированы в отдельных хорошо разделившихся пиках, представленных на хроматограмме (рис. 1). В рекомбинантной нуклеазе одна из фракций была основной и
НУКЛЕАЗЫ Serratia marcescens
331
^280 (—) Активность x 10 б, ед./мл ( - 7
3.0-1 -
2.0-
1.0-
400 мл
Рис. 1. Хроматография природной нуклеазы на колонке с DEAE-целлюлозой DE-52 (Whatman). Элюция проводилась в градиенте рН (8.25 - 7.20) 50 мМ трис-HCl-буфера со скоростью 45 мл/ч.
97
66 45
31
St
1
3
Рис. 2. ЗОБ-ПААГ-электрофорез фракций нуклеаз, выделенных хроматографией на ЙЕАЕ-целлюлозе. 51 - маркеры молекулярных масс (приведены М, кДа). 1,2- образцы природной нуклеазы, соответствующие пикам / и 2 хроматограммы (рис. 1); 3 - образец минорной фракции рекомбинантной нуклеазы, выделенной на месте ожидаемого пика У.
элюировалась единым мощным пиком, позиция которого совпадала с положением пика 2 на хро-матограмме нативной нуклеазы, другая составляла незначительную часть препарата и проявлялась лишь слабой нуклеазной активностью в области рН, соответствующей элюции пика 1 (рисунок не приводится).
805-ПААГ-электрофорез показал гомогенность каждой из фракций по молекулярной массе белкового компонента. Так, все белковые составляющие каждой из фракций локализовались в одной четко очерченной полосе, позиция которой соответствовала относительной молекулярной массе около 30000 (рис. 2). Однако небольшие различия в относительной подвижности белков свидетельствовали о разнице в молекулярных массах белковых компонентов, входящих в состав различных фракций.
Изоэлектрофокусирование в комбинации с анализом энзимограмм подтвердило гомогенность фракции природной нуклеазы (рис. За, б, колонка 2), выделившейся в пике 2, и основной фракции рекомбинантного фермента (рисунок не показан). Обе фракции содержали единственный белковый компонент, характеризующийся изо-электрической точкой 6.8. Ранее подобная изо-электрическая точка была определена для изо-формы 5т2 природной нуклеазы [9], а также для рекомбинантной формы фермента, представляющей собой зрелый белок [5], т.е. белок, полностью соответствующий по первичной структуре нуклеотидной последовательности структурного гена нуклеазы [2]. Таким образом, становилось очевидно, что все четыре нуклеазы (изоформа 5//г2 природной нуклеазы [9], "зрелая" форма рекомбинантной нуклеазы [5], основная фракция
рекомбинантной нуклеазы и одна из двух фракций природной нуклеазы, выделенные при проведении данного исследования) представляли собой один и тот же белок с р/ 6.8 и молекулярной массой 26705.8. Данный вывод был подтвержден результатами электроспрей-масс-спектрометри-ческого анализа, показавшего идентичность пол-носканового и подсканового спектров двух сравниваемых компонентов рекомбинантной (рисунок не приводится) и природной нуклеазы (рис. 4а, б) и позволившего рассчи тать массы этих компонентов (р/ 6.8) с точностью до 0.0015%. Полноскановый спектр (рис. 4а) состоял из единственной серии
рН 9.5
8.3
7.4 7.0
5.9 5.2
(а)
(б)
St / 2 J
12 3
Рис. 3. Изоэлектрофокусирование (а) и энзимограм-мы (б) фракций нуклеаз, выделенных хроматографией на DEAE-целлюлозе. St - р/-маркерные белки; I - 3 - см. рис. 2.
100-
50
(а)
ui
(M+22Н)
22+
jJwvMsJs
"Т—I—I—i—i—p-r 800 1000
JUL.
Г 1 1—ri—Г '1~1—Г"Т
1500 1950
Рис. 4. Электроспрей-масс-спектры изоформ природной и рекомбииантной нуклеаз: а - полноскановый масс-спектр компонента природной нуклеазы, выделенного во фракции из пика 2 (рис. 1); б - г - подска-новые масс-спектры высокомолекулярных ионов (М + 22Н)22+: б - компонент природной нуклеазы, выделенный из фракции пика 2 (рис. 1); в - фракция природной нуклеазы, выделенная в пике 1 (рис. 1); г-минорная фракция рекомбииантной нуклеазы. Пики: а - "зрелая" форма нуклеазы; Ь - вариант нуклеазы с Мт на 42 а. е. м. меньше, чем молекулярная масса "зрелого" белка; с - е - изоформы с недостающими одним, двумя, тремя М-концевыми аминокислотными остатками. Показанные спектры являются средними из 30 сканирований.
многозарядных ионов с зарядом от 14+ до 31+. Подскановый профиль иона с зарядом 22+ при массовом числе (т/г) 1175 - 1240 (рис. 46) содержал один пик (а). Молекулярная масса нуклеаз с р/ 6.8 составляла 26706.2 - 26708.2 Да.
Две другие фракции, минорная (рекомбииантной нуклеазы) и выделенная в пике 1 (природной нуклеазы), оказались гетерогенными. Изоэлект-рофокусирование вместе с анализом энзимо-грамм показало, что минорная фракция рекомбииантной нуклеазы (рис. За, б, колонка 3) и фракция из пика 1 природного фермента (рис. За, б, колонка 1) включали в себя три компонента, характеризующиеся изоэлектрическими точками 6.8, 7.3 и 7.4. Интересно, что во фракции природного фермента компоненты с р/ 7.3 и 7.4 были главными, а компонент с р/ 6.8 - дополнительным к ним. Напротив, в минорной фракции реком-бчнантной нуклеазы главным был компонент с р/6.8, а компоненты с р/ 7.4 и 7.3 - дополнительными к нему. Аналогичная картина была выявлена для обеих изучаемых фракций методом элекстроспрей-масс-спектрометрии. Полноска-новые спектры обеих изучаемых фракций содержали несколько серий пиков, что свидетельствовало о гетерогенности препаратов. Подскановые профили высокомолекулярных ионов с зарядом 22+, выявили пять компонентов (я - е) в случае природной нуклеазы (рис. 4в) и четыре компонента (я - d) при исследовании минорной фракции рекомбинантного фермента (рис. 4г), причем в первом случае главными были компоненты с, е, тогда как во втором - компонент а, соответствующий "зрелой" форме нуклеазы с р/ 6.8.
Молекулярные массы компонентов а - е, выявленные с помощью ЭСМС (таблица), позволили предположить, что компоненты с, d и е -N-концевые варианты "зрелой" формы нуклеазы, образованные за счет отщепления n-koh-цевых аминокислотных остатков Asp, Asp-Thr и Asp-Thr-Leu соответственно. Определение N-koh-цевой аминокислотной последовательности некоторых из компонентов подтвердило это предположение. Показано, что один из преобладающих компонентов (вариант с) начинался с Thr, соответствующего аминокислоте в позиции 2, другой (вариант е) - с Glu, соответствующего позиции 4. Таким образом, компонент е соответствовал изо-форме s/tji природной нуклеазы, ранее частично охарактеризованной [9]. Компоненты с и d ранее
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.