МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 5, с. 804-822
= ДНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДК 577.113.3:547.963.057
НУКЛЕОТИД-ЗАВИСИМАЯ ДЕГРАДАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДНК- И РНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ
© 2004 г. В. В. Сосунов*, Л. С. Викторова*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991 Поступила в редакцию 09.03.2004 г.
Настоящий обзор посвящен двум недавно обнаруженным реакциям: 1) реакции выщепления 3'-кон-цевого нуклеотида растущей цепи ДНК в присутствии относительно высоких концентраций некомплементарных r/dNTP либо r/dNDP, катализируемой различными ДНК-полимеразами (реакция псевдопирофосфоролиза); 2) реакции выщепления 3'-концевого нуклеотида РНК-транскрипта РНК-полимеразами, стимулируемой некомплементарными r/dNTP. Механизм реакций для ДНК- и РНК-полимераз различен. В случае ДНК-полимераз в присутствии некомплементарных нуклеозид-трифосфатов 3'-концевой нуклеотид ДНК выщепляется в виде динуклеозид-5',5"-тетрафосфата, тогда как в случае РНК-полимераз некомплементарные нуклеозидтрифосфаты стимулируют 3'—>-5'-экзонуклеазное расщепление РНК. В обзоре представлен материал, касающийся возможного участия реакции псевдопирофосфоролиза, катализируемой обратной транскриптазой (OT) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), в механизме резистентности ВИЧ к нуклеозидным ингибиторам OT, в частности, к азидотимидину. Обсуждаются также другие механизмы устойчивости ОТ к нуклеозидным ингибиторам.
Ключевые слова: ДНК-полимераза, РНК-полимераза, обратная транскриптаза ВИЧ, некомплементарные нуклеозидтрифосфаты, устойчивость к нуклеозидным ингибиторам.
NUCLEOTIDE-DEPENDENT DEGRADATION OF NUCLEIC ACIDS BY DNA AND RNA POLYMERASES, by V. V. Sosunov, L. S. Victorova (Engelhardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *E-mail: vsosunow@hotmail.com; lvictorova@hotmail.com). In this review we summarize the current knowledge about recently discovered reactions of nucleotide-dependent nucleic acid degradation catalyzed by DNA and RNA polymerases. These reactions consist in the excision of the 3'-nucleotide of nascent DNA or RNA chain in the presence of non-complementary r/dNTPs. In the case of DNA polymerases the dinucleoside-5',5"-tetraphosphate as a product of the reaction is formed. In contrast, in the case of RNA polymerases non-complementary r/dNTPs stimulate 3'—»-5' exonuclease degradation of RNA transcript. The possible role of these reactions in fidelity of DNA and RNA synthesis, in resistance of HIV reverse transcriptase towards nucleoside inhibitors is discussed.
ВВЕДЕНИЕ
Многие ДНК-полимеразы (ДНКП) помимо функции синтеза ДНК обладают рядом дополнительных активностей. Все ДНКП способны осуществлять пирофосфоролиз - реакцию, обратную полимеризации. Кроме того, ряд ДНКП имеет до-
полнительный активный центр, осуществляющий 3'—-5'-экзонуклеазную реакцию. Подобная активность описана для прокариотических ДНКП I [1] и эукариотических ДНКП 5, £, и £ (по-лимераза а обладает такой активностью лишь у некоторых видов) [2]. ДНКП I прокариот обладают также дополнительной 5'—»-3'-экзонуклеаз-
Принятые сокращения: a.о. - аминокислотные остатки; ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ВМП - вирус миелоблас-тоза птиц; ДНКП - ДНК-полимераза; OT - обратная транскриптаза; РНКП - РНК-полимераза; Ap4ddA и Ap4AZT - динук-леозид-5',5"-тетрафосфаты; AZT - 2',3'-дидезокси-3'-азидотимидин; AZTTP - 2',3'-дидезокси-3'-азидотимидин-5'-трифосфат; ddA - 2',3'-дидезоксиаденозин; ddNTP - 2',3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфат; d4TMP и d4TTP - 2',3'-дидезокси-2',3'-диде-гидротимидин-5'-моно- и 5'-трифосфат соответственно; FddATP - 2'-Р-фтор-2',3'-дидезоксиаденозин-5'-трифосфат; кса1 -каталитическая константа скорости реакции; ГС50 - концентрация вещества, при которой реакция ингибируется на 50%; К& - константа диссоциации; Кп1 - константа Михаэлиса; Кр^ - константа реакции полимеризации; M-MuLV - вирус лейкоза мышей Молони; NMP, NDP, NTP - нуклеозид-5'-моно, -ди- и -трифосфат соответственно; РМЕА и РМЕАрр - 9-(2-фос-фонилметоксиэтил)аденин и его дифосфат соответственно; PP^ - неорганический пирофосфат; r/dNTP - рибо/дезоксири-бо№ГР, 3ТС - (-)Р^-2',3'-дидезокси-3'-тиоцитидин; 3ТСГР - (-)Р^-2',3'-дидезокси-3'-тиоцитидин-5'-трифосфат.
* Эл. почта: vsosunowhotmail.com; lvictorovahotmail.com
ной активностью, осуществляемой отдельным активным центром.
Клеточные РНК-полимеразы (РНКП) также способны катализировать реакцию пирофосфо-ролиза. Кроме этого, они обладают эндонуклеаз-ной активностью, которая значительно стимулируется в присутствии белковых факторов GreA и GreB у прокариот [3] и TFIIS - у эукариот [4, 5]. Предполагают, что эндонуклеазное расщепление РНК осуществляется в том же активном центре, что и реакции полимеризации и пирофосфороли-за. Эукариотическая РНКП II также обладает эк-зонуклеазной активностью, которая, как и эндо-нуклеазная, стимулируется белковым фактором TFIIS [6]. Показано, что фактор-стимулируемая экзонуклеазная активность РНКП II играет важную роль в коррекции синтеза РНК in vitro [7].
Недавно была обнаружена новая реакция, катализируемая различными ДНКП, которая заключается в выщеплении 3'-концевого нуклеотида растущей цепи ДНК в присутствии относительно высоких концентраций некомплементарных r/dNTP либо r/dNDP c образованием, соответственно, ди-нуклеозид-5',5''-тетра- и -трифосфатов (псевдопи-рофосфоролиз) [8, 9]. В случае РНКП Escherichia coli реакции псевдопирофосфоролиза обнаружено не было, однако было показано, что некомплементарные r/dNTP стимулируют 3'—>-5'-экзонукле-азное отщепление 3'-концевого нуклеотида РНК-транскрипта [10].
В настоящем обзоре представлены данные, свидетельствующие о вкладе реакции псевдопирофосфоролиза в резистентность вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ. Роль этой реакции может также заключаться в коррекции синтеза ДНК, что особенно важно для ферментов, не обладающих корректирующей 3'—>-5'-экзонуклеазной активностью (например, ОТ ретровирусов, в том числе и OT ВИЧ, эукари-отические ДНКП а и ß). Обсуждается также возможность участия стимулируемой некомплементарными r/dNTP экзонуклеазной активности РНКП E. coli в коррекции синтеза РНК.
НУКЛЕОТИД-ЗАВИСИМАЯ ДЕГРАДАЦИЯ КАК ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ КОРРЕКЦИИ СИНТЕЗА ДНК
В процессе репликации ДНК в клетках E. coli одна ошибка обнаруживается на 109-1010 нуклео-тидов. При этом в экспериментах in vitro ДНКП включают в цепь ДНК один "ошибочный" на каждые 104-105 нуклеотидных остатков [11]. Такая точность достигается за счет образования прочных водородных связей между комлементар-ными нуклеотидами и, возможно, благодаря пространственной конфигурации канонических ком-
плементарных пар (A=T, G=C), которая распознается активным центром фермента (последнее показано для ДНКП I E. coli). Таким образом, точность синтеза in vivo должна поддерживаться за счет дополнительных энзиматических механизмов. Первым из них может считаться 3'—»-5' экзонуклеазная активность, с помощью которой возможно немедленное отщепление уже включенного в цепь ДНК "ошибочного" нуклеотида. В настоящее время подобная активность описана для прокариотических ДНКП типа I [1] и ряда эукариотических ДНКП [2]. У этих полимераз имеется специальный экзонуклеазный активный центр. Показано, что при встраивании в цепь некомплементарного нуклеотида резко замедляется скорость его транслокации из (i + 1)- в i-сайт и, вследствие этого, замедляется скорость включения следующего комплементарного нуклеотида. За это время З'-конец растущей цепи ДНК перебрасывается из полимеразного активного центра в экзонуклеазный, где и происходит удаление некомплементарного нуклеотида. Благодаря наличию корректирующей экзонуклеазной активности точность синтеза ДНК повышается в 102-103 раз. Таким образом, отбор нуклеотидов самой по-лимеразой в совокупности с корректирующей экзонуклеазной активностью обеспечивают точность синтеза ДНК лишь на уровне один "ошибочный" нуклеотид на 106-108 включенных, что существенно меньше точности, наблюдаемой in vivo. Дополнительная точность синтеза ДНК достигается за счет работы отдельных ферментативных систем, осуществляющих репарацию ДНК уже после ее синтеза. К таким системам помимо ферментов, осуществляющих собственно репарацию [11-13], следует отнести и автономные 3'—*-(г)5'-экзонуклеазы [14, 15].
Возможны ли еще какие-либо механизмы коррекции синтеза ДНК? Потенциально к таким механизмам можно отнести недавно обнаруженную реакцию псевдопирофосфоролиза, катализируемую различными ДНКП [8, 9]. Ее механизм аналогичен механизму реакции пирофосфоролиза, при этом в роли пирофосфата выступают aß-фо-сфаты стимулирующего NDP, либо ß,y-фосфаты стимулирующего NTP:
5'-...pNpNpNpNOH + ppp(r/d)N" 5'-...pNpNpNOH + (r/d)N"-5'-pppp-5'-N' 5'-...pNpNpNpNOH + pp(r/d)N" 5'-...pNpNpNOH + (r/d)N"-5'-ppp-5'-N'
Реакция псевдопирофосфоролиза обратима. Продукты этой реакции - динуклеозид-5',5''-тет-ра- и -трифосфаты - являются субстратами для различных ДНКП при синтезе ДНК [16].
Показано, что комплементарные dNTP подавляют эту реакцию. Комплементарный dNTP ин-
гибирует реакцию псевдопирофосфоролиза даже в том случае, когда он не может включаться в цепь ДНК (в работе использовали праймер, содержащий остаток ddAMP на 3'-конце) [8]. Эти данные свидетельствуют о том, что псевдопиро-фосфоролиз, как и пирофосфоролиз, осуществляется тогда, когда З'-конец праймера занимает в активном центре фермента (г + 1)-сайт. Комплементарный dNTP также связывается в (г + 1)-сай-те, вытесняя З'-концевой нуклеотид праймера в г-сайт, за счет чего, вероятно, и происходит инги-бирование реакции.
О том, что псевдопирофосфоролиз катализируется именно в полимеразном активном центре свидетельствует и то, что в случае ОТ ВИЧ эта реакция и реакция полимеризации приблизительно в равной степени ингибируются (1С50 = 9 мкМ для псевдопирофосфоролиза и 18.5 ± 4.5 мкМ -для РНК-зависимого синтеза ДНК) соединением С1-Т1ВО [(+)-8-4,5,6.7-тетрагидро-9-хлор-5-ме-тил-6-(3-метил-2-бутенил)-имидо-[4,5,1-ол]-[1,4]-бензодиазепин-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.