ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 2, с. 170-175
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 577.21:598.112
НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО ЛОКУСА Du215 (arm) У ПАРТЕНОВИДА Darevskia armeniaca (Lacertidae)
© 2007 г. Д. Н. Малышева1, А. А. Вергун1, 2, О. Н. Токарская1, Г. А. Севастьянова2,
И. С. Даревский3, А. П. Рысков1
1 Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; e-mail: M.Dariya@gmail.com 2 Московский педагогический государственный университет, кафедра биологической и органической химии, Москва 119882 3 Зоологический институт Российской академии наук, Санкт-Петербург 199034
Поступила в редакцию 20.07.2006 г.
В настоящей работе с помощью монолокусного ПЦР-анализа, используя пары праймеров, подобранные для локуса Du215 Darevskia unisexualis, проводили изучение аллельного полиморфизма ор-тологичного локуса в популяциях родственного партеновида D. armeniaca. Установлено, что Du215 (arm) является полиморфным и в популяциях партеновида D. armeniaca (n = 127) представлен как минимум тремя аллельными вариантами, которые различаются размером и составом микросателлит-ного кластера, а также одиночными нуклеотидными заменами в прилежащих ДНК. Показано, что микросателлитный кластер локуса Du215 (arm), в отличие от Du215, содержит не только GATA-, но и ^АСА)-повторы, которые отсутствовали у D. unisexualis. Таким образом, в работе впервые получена информация о молекулярной природе аллельного полиморфизма одного из микросателлит-ных локусов у партеновида D. armeniaca.
Тандемно организованные повторяющиеся последовательности ДНК различных типов являются неотъемлемой частью генома эукариот и могут находиться как в кодирующих, так и в неко-дирующих его участках. Они варьируют по длине кластера и размеру повторяющегося звена. Из-за сходства по структурной организации с сателлит-ной ДНК эти последовательности получили название "мини-" и "микросателлитов". Благодаря высокой скорости мутирования микросателлиты играют важную роль в эволюции геномов, создавая и поддерживая количественное генетическое разнообразие в популяциях [1]. К хорошо изученным микросателлитам относится семейство GA-ТА^АСА-повторов ДНК [2], впервые обнаруженное на W-xромосоме одного из видов змей -Бищагш fasciatus [3]. Общее количество и организация таких повторов и их производных значительно варьируют у разных видов. Представители этого семейства повторов встречаются во всех исследованных эукариотических геномах (растения, различные виды беспозвоночных, млекопитающие, включая приматов и человека), что делает возможным их использование в качестве генетических маркеров в различных областях популяционной и эволюционной биологии [2, 3].
Исследования индивидуальных микросател-литных локусов показали, что изменения, происходящие в них, весьма разнообразны в зависимости от видов живых организмов, типов повторов,
аллелей, а также возраста и пола. Однако проблема генезиса микросателлитных локусов, интенсивно изучаемая на человеке [4] и некоторых других двуполых видах [5], мало исследована на видах с клональным типом размножения.
Партеногенетические ящерицы D. armeniaca повсеместно распространены в Центральной Армении и южных районах Грузии. Как и другие однополые виды рода Darevskia, D. armeniaca имеет гибридное происхождение (родительские виды D. valentini и D. mixta), характеризуется диплоидным набором хромосом, высокой фиксированной гетерозиготностью аллозимных локусов [6] и незначительным полиморфизмом сайтов рестрикции митохондриальной ДНК [7]. Исследования аллозимных спектров D. armeniaca обнаружили изменчивость четырех из 35 изученных локусов, выражающуюся в распространении двух основных и двух минорных аллозимных вариантов в популяциях этого вида [6]. Наряду с аллозимны-ми клонами у D. armeniaca обнаружены две морфологические формы с характерной вариацией дорзальной окраски туловища [8].
Как было показано ранее [9, 10], все особи D. armeniaca характеризуются видоспецифическим ДНК-фингерпринтным профилем, отличным от ДНК-фингерпринтных спектров других партенови-дов рода Darevskia. Также было показано, что на фоне видоспецифических спектров выявляется генетическая неоднородность по некоторым мик-
росателлитным маркерам [10]. Более того, фин-герпринтный анализ семей выявил довольно высокую частоту мутаций по (GATA)n- и (GACA)n-содержащим локусам среди потомков первого поколения [11]. Мутантные фингерпринтные фенотипы, выявляемые у потомков, отличались от материнских по электрофоретической подвижности одного или нескольких фрагментов и встречались также в популяционной выборке. Таким образом, обнаруженные мутации в семьях D. armeniaca положительно коррелируют с высокой популяционной изменчивостью этих маркеров. В то же время природа вариабельности фингерпринтных маркеров остается неясной. Она может быть вызвана различными причинами, в том числе мутациями в сайтах рестрикции и вариациями в участках ДНК, содержащих микросателлитный кластер [12-15]. Ранее нами было клонировано и секвенировано несколько локусов D. unisexualis, содержащих микросателлит (GATA)n [16]. Среди них локус Du215 оказался полиморфным и в популяциях D. unisexualis (n = 65) представлен как минимум тремя аллельными вариантами, различающимися по длине микросателлитного кластера.
В настоящей работе с помощью локус-специ-фического ПЦР выявлены аллельные варианты локуса Du215 в популяциях другого партеновида рода Darevskia - D. armeniaca (ортологичный локус обозначен как Du215 (arm)) и определены их различия на уровне первичной структуры ДНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Локус-специфический ПЦР-анализ проводили на выборке 127 образцов ДНК D. armeniaca из 15 популяций Центральной и Северо-Восточной Армении. Кровь консервировали в 0.5 М растворе ЭДТА рН 8.0 и выделяли ДНК с помощью стандартного фенол-хлороформного метода с использованием протеиназы К.
ПЦР-амплификацию ДНК D. armeniaca проводили с использованием пары праймеров, ранее подобранных для локуса Du215 партеновида D. unisexualis [16, 17]. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащем 1 х буфер для Tag-полимеразы ("Ди-алат"), 250 мкМ каждого dNTP, 2 мМ MgCl2, 10 мкМ каждого праймера (5'-CAACTAGCAG-TAGCTCTCCAGA-3'; 5'-CCAGACAGGCCCCA-ACTT-3'), 0.8 ед. Tag-полимеразы ("Диалат"). В реакционную смесь добавляли 20 нг геномной ДНК. Амплификацию проводили на четырехка-нальном ДНК-амплификаторе ТП4-ПЦР-01-Тер-цик при следующих температурных режимах: денатурация 3 мин (94°С); амплификация 30 циклов (94°С - 1 мин, 58°С - 40 с, 72°С - 40 с); элонгация 5 мин (72°С).
Продукты амплификации фракционировали электрофорезом в 8%-ном полиакриламидном
геле (ПААГ) и выявляли окрашиванием бромистым этидием. Для установления природы ампли-фицированных ДНК проводили их экстракцию из полиакриламидного геля, клонирование в E. coli в составе вектора pMos Blue ("Amersham") по стандартному протоколу фирмы-производителя. Определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации проводили по методу Сэнгера с помощью набора реактивов ABI PRIsM®BigDyeTM Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Нуклеотидные последовательности выравнивали с использованием программы MegAlign 4.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены результаты моноло-кусного ПЦР-анализа особей D. armeniaca из 15 изолированных популяций Армении. Видно, что локус Du215 (arm) является гетерозиготным и в популяциях партеновида D. armeniaca представлен как минимум тремя аллельными вариантами, различающимися по электрофоретической подвижности продуктов амплификации в интервале 200-250 нуклеотидных пар (отмечены стрелками). Причем исследованные популяции отличаются между собой по частоте встречаемости этих аллельных вариантов (табл. 1).
Интересно отметить, что все особи из популяции Такярлу, представленной двумя морфофор-мами, различающимися по окраске туловища, оказались электрофоретически инвариантными и гетерозиготными по исследуемому локусу (рис. 1, дорожки 1-21). Гетерозиготными оказались и особи из так называемой Украинской популяции (особи из локальной, изолированной популяции "Медведь-гора" в Армении, интродуцированные в 1964 г. на Украину [18]). Следует отметить, что в данной популяции было обнаружено три аллельных варианта Du215 (arm) (дорожки 22-38). Три аллельных варианта этого локуса, различавшихся по электрофоретической подвижности, были выявлены и в популяции Алаверды (дорожки 40-42). В остальных исследованных популяциях Du215 (arm) давал два четко различавшихся по электрофоретической подвижности амплифи-канта и, по-видимому, представлен только двумя аллельными вариантами.
Для изучения молекулярной природы аллель-ного полиморфизма локуса Du215 (arm) в популяциях D. armeniaca было проведено секвенирова-ние ПЦР-продуктов, соответствующих трем его ал-лельным вариантам. Как видно из данных рис. 2, последовательности аллельных вариантов Du215 (arm) партеновида D. armeniaca отличаются от последовательности клона Du215 партеновида D. unisexualis (GenBank Ac No AY574978) размером и составом микросателлитных кластеров, а
пн
300-
200 —
пн 300
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21
✓ »4. - -
-
39 41 43 45 47 49
200
пн 70 72 74 7б 78 80 82 84 8б 88 300
200
пн 11011211411б11812012212412б
300
пн 22 24 2б 28 30 32 34 3б 38
250" ШйШШ*ШШ*Ш***ы*Н#>
200- — 51 53 55 57 59 б1 б3 б5 б7 б9
200-
пн 90 92 94 96 98 100102104106108 300-
200-■
200
Рис. 1. Электрофорез в ПААГ ПЦР-продуктов локуса Du215 (arm) особей D. armeniaca из разных популяций: Такярлу (1-21), Украинская популяция (22-38), Лчашен (39), Алаверды (40-42), Меградзор (43-50), Медведь-гора (51-62), Пушкинский перевал (63-69), Семеновский перевал (70-77), Папанино (78-81), Теж (82-89), Степанаван (90-98), Кут-чак (99-105), Гош (106), Сотк (107-109) и Артик (110-127). Маркерный фрагмент - 50 пн ("Amersham"). Стрелками обозначены аллельные варианты.
10 20 30 40 50 б0
аллель 1 CCAGACAGGCCCCAACTTGCTGAACTTCCAGCATCTACTGAAGGTTTTATTTTTCCTGCA D. armeniaca аллель 2 CCAGACAGGCCCCAACTTGCTGAACTTCCAGCATCTACTGAAGGTTTTATTTTTCCTGCA
_алле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.