БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.922-928
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТКИНАЗА И GTP-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СОПРЯЖЕНИЯ
© 2008 г. Д.Н. Орлов, Н.Я. Орлов
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московской области
Поступила в редакцию 26.06.08 г.
В работе анализируются современные данные, указывающие на то, что одним из путей реализации мультифункциональной роли нуклеозиддифосфаткиназы может быть ее участие в активации и(или) регуляции гетеротримерных GTP-связывающих белков как ключевых компонентов систем клеточной трансдукции. Приведены данные, указывающие на то, что одна из изоформ нуклеозиддифосфаткиназы динамически взаимодействует с GTP-связывающим белком палочек сетчатки трансдуцином и фосфорилирует его Р-субъединицу по одному из поверхностных остатков гистидина (His266), что ведет к последующему переносу фосфата на GDP в активном центре а-субъединиц GTP-связывающих белков и их активации. Рассмотрены преимущества такого механизма по сравнению с известным механизмом активации GTP-свя-зывающих белков в результате индуцируемого активированным рецептором обмена связанного GDP на свободный GTP.
Ключевые слова: нуклеозиддифосфаткиназа, G белки, трансдуцин, системы клеточной трансдукции, гистидинкиназа.
Было принято считать, что единственной функцией нуклеозиддифосфаткиназы (КОР-ки-наза, ЕС 2.7.4.6) является перенос у-фосфата от нуклеозидтрифосфатов на нуклеозиддифосфаты [1]. Однако в течение последних 10 - 15 лет было установлено, что КОР-киназа может также функционировать в качестве супрессора метастаз (пт23), регулятора морфогенеза (Л-№ё), фактора транскрипции (РиБ) и ингибитора диф-ференцировки (1-Гас1;ог) (см., например, [2]). Эти результаты, а также ряд других данных [3-11], способствовали формированию точки зрения, согласно которой КОР-киназа, скорее всего, является мультифункциональным белком, и стимулировали работы по поиску молекулярных механизмов реализации КОР-киназой такой мультифункциональной роли. По-видимому, такие механизмы достаточно разнообразны, однако в настоящей работе будут рассматриваться лишь те данные, которые свидетельствуют об участии КОР-киназы в активации
Сокращения: ЫБР киназа - нуклеозиддифосфаткиназа (ЕС 2.7.4.6); ЫБР киназы а и р - а- и Р-изоформы рекомбинантных ЫБР-киназ крысы; НСП - наружные сегменты палочек; О-белки - гетеротримерные ОТР-свя-зывающие белки; О1 - трансдуцин, О - белок системы фототрансдукции НСП сетчатки; Я - родопсин, рецептор света НСП сетчатки; Я* - фотоактивированный родопсин; Я*О1 комплекс - комплекс между Я* и О1 в фоторецеп-торных мембранах НСП сетчатки; ОТРрЗ] - гуанозин 5'-[у-тио]трифосфат.
и(или) регуляции гетеротримерных ОТР-связы-вающих белков (О-белков), являющихся ключевыми элементами большинства систем клеточной трансдукции.
ИЗОФОРМЫ ^Р-КИНАЗЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
В большинстве случаев КОР-киназы являются гексамерами, состоящими из субъединиц с молекулярной массой около 17 кДа. В отличие от ферментов низших организмов, гексамеры КОР-киназы млекопитающих состоят из двух типов спонтанно ассоциированных субъединиц по 152 аминокислотных остатка каждая и, таким образом, существуют в клетке виде набора изоформ [12,13]. Субъединицы кодируются двумя независимыми генами, но характеризуются высокой степенью гомологии (90%), а все различия их первичных структур локализованы лишь в двух небольших вариабельных областях У1 (остатки 37-50, семь замен) и У2 (остатки 131-150, шесть замен). Более того, изоформы КОР-киназы очень близки по своим каталитическим характеристикам, способу гексамерной организации, строению активного центра и трехмерной структуре [14]. Физиологический смысл существования в клетках млекопитающих изоформ КОР-киназы с близкими каталитическими и структурными свойствами пока не ясен
полностью и является предметом многих исследований.
NDP-КИНАЗА И GTP-СВЯЗЫШАЮЩИЕ БЕЛКИ. ПЕРВЫ1Е РЕЗУЛЬТАТЫ
Для объяснения как физиологического смысла существования NDP-киназ в клетках млекопитающих в виде изоформ, так и муль-тифункциональной роли этих ферментов было предположено [2-7,15,16], что мишенями для регуляторного действия NDP-киназ могут быть различные GTP-связывающие белки, в том числе и гетеротримерные GTP-связывающие белки (G-белки), участвующие в процессах передачи информации в системах клеточной трансдукции [17,18]. В общей форме это предположение было высказано около 30 лет назад при исследовании роли различных нуклеотидов в процессах функционирования некоторых представителей семейства GTP-связывающих белков, в частности, при сборке тубулиновых микротрубочек [19-21], активации G-белков аденилатциклазной системы [22] и работе факторов элонгации [23]. Главным основанием для такого предположения явились данные о том, что при активации указанных выше представителей семейства GTP-связывающих белков эффективно функционировал не только GTP, но и другие доноры макроэргического фосфата, в частности АТP. Было предположено, что такой процесс катализируется NDP-киназой. При этом допускалось, что NDP-киназа может непосредственно фосфорилировать GDP, локализованный в активных центрах GTP-связывающих белков. При попытке очистить препараты GTP-связывающих белков от активности NDP-киназы, создалось впечатление о наличии специфического взаимодействия между этим ферментом и различными представителями семейства GTP-свя-зывающих белков, однако однозначные доказательства такого взаимодействия отсутствовали.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ NDP-КИНАЗЫ С КОМПЛЕКСОМ PОДОПCИН-ТPАНCДУЦИН
Pаботы по анализу предположения о возможном сопряжении между работой NDP-ки-назы и функционированием G-белка были выполнены на наружных сегментах палочек (НСП) сетчатки позвоночных [15]. НСП являются очень удобным объектом для таких исследований. Действительно, этот специализированный отдел палочки сетчатки содержит мембранный рецептор света родопсин (R) и G-белок транс-дуцин (Gt) в предельно высоких концентрациях
(около 5 и 0,5 мМ соответственно), на долю которых приходится около 80% белка НСП. Кроме того, фоторецепторная мембрана, содержащая родопсин, может быть использована в качестве сорбента, специфически взаимодействующего с рядом компонентов системы фото-трансдукции (трансдуцином, аррестином, ро-допсинкиназой и т.д.) [24]. В частности, фотоактивированный родопсин (R*) образует функциональный мембранный комплекс с Gt (R*Gt-комплекс), который в присутствии микромолярных концентраций GTP и его аналогов при определенных условиях (низкая ионная сила) диссоциирует на R*, локализованный в мембранах, и водорастворимый Gt [24]. Такой подход позволяет легко получать высокоочищен-ный Gt и широко используется при исследовании молекулярных механизмов работы зрительной системы. НСП содержат и NDP-киназу, внутриклеточная концентрация которой достаточно высока (« 10 мкМ) [15]. Одной из основных функций NDP-киназы в наружных сегментах палочек является фосфорилирование GDP до GTP, который, в свою очередь, принципиально необходим для обеспечения функционального цикла трансдуцина независимо от механизма его активации и синтеза медиатора cGMP гуанилатциклазой НСП [25]. Донором в этой рекции является АТP, продуцируемый во внутреннем сегменте палочки митохондриями.
Использование препаратов НСП сетчатки быка показало [15], что водорастворимая NDP-киназа НСП связывается с Gt в том случае, когда он образует мембранный R*Gt-комплекc и переходит в свободное состояние, когда такой комплекс диссоциирует в присутствии GTP и его аналогов. Трансдуцин является необходимым участником процесса взаимодействия: удаление Gt из фоторецепторных мембран блокирует связывание, а добавление Gt к мембранам его восстанавливает [15]. Взаимодействие характеризуется высокой специфичностью - значение Kd для взаимодействия между NDP-ки-назой и комплексом R*Gt составляет около 5 нМ [15]. Такие результаты свидетельствовали в пользу предположения о существовании функционального взаимодействия между NDP-кина-зой и Gt в составе R*Gt-комплекcа.
ИЗОФОPМ-CПЕЦИФИЧНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ NDP-КИНАЗЫ С КОМПЛЕКСОМ
PОДОПCИН-ТPАНCДУЦИН
Исследование взаимодействия рекомбинант-ных гомогексамерных NDP-киназ а и Р крысы, содержащих только один тип субъединиц (а
или Р), с очищенными от эндогенной N0?-киназы фоторецепторными мембранами НСП сетчатки быка, показало, что NDP-киназы а и Р принципиально отличаются по сродству к комплексу Я*О1 [26]. NDP-киназа а взаимодействовала с комплексом Я*О1 подобно эндогенной NDP-киназе НСП сетчатки быка « 5 нМ), тогда как сродство NDP-киназы Р к комплексу Я*О1 было ниже не менее чем в 100 раз. Таким образом, с помощью простой модельной системы впервые было показано, что изоформы NDP-киназы могут играть различную функциональную роль: NDP-киназа а, в отличие от изоформы Р, была сопряжена с представителем семейства О-белков. Более того, использование синтетических пептидов, имитирующих различные участки NDP-киназ а и Р, показало, что только пептид, имитирующий участок VI в а-(но не Р-) изоформе, блокирует взаимодействие между NDP-киназой фоторецепторов и Я*О1;-комплексом. Это дало первые основание полагать, что именно участок VI и определяет специфичность функционирования изоформ NDP-киназы, по крайней мере, по отношению к О1;.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАЗЛИЧИЯ В ПОВЕДЕНИИ ИЗОФОРМ
Частичный ответ на вопрос о физико-химических основах различий в поведении изо-форм был получен в результате исследования изолированных рекомбинантных а- и Р-изо-форм NDP-киназы крысы методом собственной белковой флуоресценции [27,28]. Оказалось, что NDP-киназы а и Р, имеющие флуоресцирующие остатки в одинаковых положениях (Тгр78,133 и 149, Туг52,67,147 и 151), тем не менее, принципиально отличаются по характеристикам собственной белковой флуоресценции (значению д, положению ^шах, форме и мультикомпонент-ности спектра, доступности флуорофоров тушителям) в растворе при рН 8 [27]. Более того, изоформы оказались различными и по структурной лабильности: в отличие от конформа-ционно-стабильной NDP-киназы Р, NDP-киназа а существует в растворе в двух структурно различных состояниях, равнов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.