РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 252-258
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
«НУЛЕВЫЕ» АЛЛЕЛИ ГЕНОВ С4 КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА В ПАТОГЕНЕЗЕ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ У ДЕТЕЙ В РОССИЙСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
© 2009 г. Н.Б. Кузьменко*, И.А. Шагина***, А.П. Продеус*, М.А. Курникова***,
Д.А. Шагин** ***, А.Ю. Щербина
*ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии МЗ РФ, Москва, Россия;
**Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия;
***Компания «Евроген», Москва, Россия
Поступила: 29.06.2009. Принята: 04.08.2009
«Нулевые» аллели генов, кодирующих С4 компонент системы комплемента (C4Q0, включая C4AQ0 и C4BQ0), предрасполагают к развитию системной красной волчанки (СКВ) в некоторых этнических группах. Целью данного исследования явилось изучение роли «нулевых» аллелей гена С4 компонента комплемента в патогенезе СКВ у детей российской популяции. В ходе данной работы было обследовано 36 детей, больных СКВ, и 50 детей без клинических признаков аутоиммунной патологии. Кроме того, вторую контрольную группу составили 26 здоровых взрослых. «Нулевые» аллели генов С4А/В были определены при помощи метода, основанного на мультиплексной ПЦР. 28-kb делеция гена C4A определялась методом «long distance» ПЦР. Наличие двунуклеотидной вставки в 29 экзоне С4 генов определялось методом аллель-специфичного ПЦР и затем подтверждалось при помощи прямого секвенирования 29 экзона. Гомозиготные дефициты генов С4А и С4В обнаруживались с одинаковой частотой среди пациентов и в группе контроля детского возраста. Нами не было найдено достоверных различий в частоте встречаемости большой делеции гена С4А в обеих группах (11% среди пациентов и 18% в контроле). Частота встречаемости двунуклеотидной вставки в 29 экзоне гена С4А была ниже, чем заявлено в опубликованных ранее исследованиях. Дефекты гена С4 среди здоровых взрослых встречаются реже, чем в контрольной группе детей. Наши данные отличаются от результатов опубликованных ранее европейских исследований, возможно, по причине этнических особенностей детей, проживающих на территории России. По результатам, полученным в данной работе, нельзя говорить о специфической роли дефектов ни гена С4А, ни гена С4В при системной красной волчанке в детской популяции россиян.
Ключевые слова: «нулевые» аллели, С4, СКВ
ВВЕДЕНИЕ
Системная красная волчанка (СКВ) — прототип аутоиммунных заболеваний, при котором поражаются различные системы и органы [1, 2]. Известно, что дефицит ранних компонентов комплемента является фактором риска для развития аутоиммунных заболеваний, включая СКВ [3, 4]. Однако волчанка имеет полигенную модель наследования, где принимают участие более 25 различных генов
Адрес: E-mail: plunge@list.ru
[5]. Гены системы комплемента, в особенности те, которые находятся в MHC III класса, занимают первые позиции среди них [6]. В частности, при полном дефиците С4 компонента комплемента системная красная волчанка развивается более, чем в 75% случаев [2, 7].
Белок С4 представлен двумя изотипичными формами, С4А и С4В, каждую из которых кодирует соответствующий ген — С4А или С4В [8]. Гены С4 расположены в MHC III класса и, в совокупности с соседними генами RP, CYP21 и TNX, составляют единый генетический модуль, называемый RCCX. Генетические пере-
стройки в этом регионе являются общими для всех четырех генов [9—11]. Число копий генов С4 в диплоидном геноме в популяции человека варьирует от 2 до 8 у различных индивидуумов, что принято называть «дозой гена» [11, 12]. Фенотипически доза гена проявляется уровнем белка в крови и зависит от количества «работающих» — экспрессирующих белок генов С4. Гены С4 компонента комплемента могут иметь неэкспрессирующий белок, или «нулевой» аллель — С4АО0 и/или С4ВО0. Полные дефициты С4А и С4В по обеим аллелям встречаются крайне редко [11].
Наиболее распространенными причинами «нулевых» аллелей или, другими словами, С4 дефицита, являются большая делеция генов С4А или С4В и соседнего с ними гена 21СУР [3, 13, 14, 16], а также точечная мутация в 29 экзоне, наличие которой ведет к образованию стоп-кодона в 30 экзоне этого же гена и, как следствие, к невозможности синтеза белка [8, 13, 16]. Эта же мутация может являться причиной «нулевого» аллеля гена С4В [17].
Цель нашего исследования — выявить гомозиготные дефициты генов С4А и/или С4В и определить их связь с развитием СКВ, а также оценить частоту встречаемости «нулевых» аллелей гена С4А в гетерозиготном состоянии в российской популяции и проявления СКВ у пациентов детского возраста с таким генетическим дефектом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты и группы контроля
В ходе данной работы было обследовано 86 детей и 26 взрослых. Всего было выделено 3 группы: основная группа включала 36 детей (11 мальчиков и 25 девочек), больных системной красной волчанкой. Первая группа сравнения составила 50 детей (26 мальчиков и 24 девочек), без клинических признаков аутоиммунной патологии. Вторая группа сравнения составила 26 взрослых добровольцев (3 мужчин и 23 женщины), также без клинических признаков аутоиммунной патологии и не имеющих родственников с таковой.
Диагноз СКВ устанавливался на основании диагностических критериев американского ревматологического колледжа (1982) [18].
Средний возраст больных на момент настоящего исследования составил 14,47±2,4 лет (от 6 до 18 лет). Девочки составляли 69,4% (25/36), мальчики — 30,6% (11/36).Средний возраст
Таблица 1. Список праймеров для определения «нулевых» аллелей генов С4 и их причин
Наимено-
№ вание олиго- Sequence (5'-3') Длина
нуклеотида
1 Ado AGGACCCCTGTCCAGTGTTAGAC 23
2 Bdo AGGACCTCTCTCCAGTGATACAT 23
3 E29.3 TTGGGTACTGCGGAATCCCC 20
4 Aup-1 CCCTGCATGCTCCTGTCTAA 20
5 Bup-1 CCCCTGCATGCTCCTATGTAT 21
6 L3-1 GGATCCAGCAGTTTCGGAAG 20
7 G11 GCTTCAGTACTTCCAGCCTGT 21
8 C4Adel TGACACAAAATAC CAG G ATG TGA 23
9 C4Anon-del CCAACATGTCTGTGCATGCTG 21
10 C4Norm29 TTGCTCTGAGAACCAGTGAC 20
11 C4Ins29 AGAACCAGTGACTGAGAGC 19
12 C4int28.1 TTAGGATCCCTGAGTGTGCC 20
дебюта заболевания в группе пациентов составил 11,47 ±3,14. Средний возраст детей в группе контроля составил 12,66±2,95 лет (от 6 до 18 лет). Достоверных различий по возрасту дебюта СКВ среди пациентов и возрасту детей группы контроля не было (р = 0,08).
Выделение геномной ДНК
Геномная ДНК выделялась из периферической крови согласно протоколу производителя при использовании наборов компании Quagen, США для выделения ДНК из образцов периферической крови и согласно протоколу производителя при помощи «Набора реагентов для выделения ДНК из различного биологического материала» Diatom DNA Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген», Россия.
ПЦР амплификация С4 «нулевых» генов
Для определения дефектов генов С4А и С4В использовалась полимеразная цепная реакция с сиквенс-специфическими праймерами. Общий список праймеров, использованных в работе, представлен в таблице 1, компоненты и условия для ПЦР 1, 2, 3 описаны в таблице 2,
Таблица 2. Компоненты и условия ПЦР 1, 2, 3
Геномная ДНК 10 нг
1 x Encyclo Taq reaction buffer (Evrogen)
дНТФ 200 [M
Праймер Dir 0,2 [M
Праймер Rev 0,2 [M
1 x Encyclo Taq Polymerase mix (Evrogen)
Общий объем реакционной смеси 25 [l
компоненты и условия для ПЦР 4 — в таблице 3. ПЦР проводили на MJ Research PTC-200 DNA Thermal Cycler, Великобритания.
ПЦР1 (определение С4АО0/С4ВО0 аллелей в гомозиготном состоянии)
Для определения «нулевых» аллелей генов С4А/В в гомозиготном состоянии использовалась полимеразная цепная реакция с сик-венс-специфическими праймерами: Е29.3 + Ado, Е29.3 + Bdo, L3-1 + Aupl, L3-1 + Bupl. Температурный режим: при 95 °C — 7 с; при 66 °C — 20 с; при 72 °C —40 с. Общее число циклов — 29.
ПЦР2 (определение 30 kb делеции гена С4А)
С помощью метода «long distance» ПЦР образцы ДНК были проанализированы на наличие/отсутствие 30 kb делеции гена С4А. Использовались праймеры: С4Adel + G11, С4Anon-del + G11. Температурный режим: при 95 °C — 7 с; при 66 °C — 20 с; при 72 °C — 40 с. Общее число циклов — 36.
ПЦР3 (определение TC вставки в 29 экзоне генов С4А и С4В)
Нами были подобраны праймеры (C4norm29 + Ado, C4norm29 + Bdo) и отработан метод аллель-специфического ПЦР, который позволяет выявлять точечную мутацию — двунуклеотидную вставку (TC) в 29 экзоне — генов С4А/В. Температурный режим: при 95 °C — 7 с; при 62 °C — 20 с; при 72 °C — 40 с. Общее число циклов — 28.
ПЦР4 c заглублением (матрица — продукт ПЦР3)
Наличие двунуклеотидной вставки было подтверждено прямым секвенированием с праймера C4Int28.1 продуктов амплификации 3 после очистки ПЦР продукта (QIAquick
Таблица 3. Компоненты и условия ПЦР4
Продукт ПЦР3
1 x Encyclo Taq reaction buffer (Evrogen) дНТФ
Праймер Dir Праймер Rev
1 x Encyclo Taq Polymerase mix (Evrogen) Общий объем реакционной смеси
25 пг
200 [M 0,2 [M 0,2 [M
25 [l
PCR Purification Kit, Qiagen). Использованные праймеры: С41ш29 + С4Ш28.1. Температурный режим: при 95 °C — 7 с; при 60 °C — 20 с; при 72 °C — 40 с. Общее число циклов — 15.
Определение нуклеотидной последовательности проводилось на секвенаторе MegaBACE 500 Amersham Biosciences, США.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Гомозиготные дефициты генов С4А или С4В
В группе детей с СКВ не обнаружено ни одного гомозиготного (т.е. полного) дефицита гена С4А. Среди детей без признаков аутоиммунных заболеваний один ребенок имел полный С4А дефицит. Гомозиготный С4В дефицит обнаружен у одного пациента с СКВ.
Гетерозиготный дефицит гена С4А
Частота встречаемости большой делеции гена С4А и псевдогена СУР21 среди пациентов с СКВ составила 11,11% (4/36) по сравнению с 18,00% (9/50) в группе контроля среди детей, что не имеет достоверных различий (р = 0,379) (рис. 1).
Гетерозиготный дефицит гена С4А, причиной которого явилась двунуклеотидная вставка в 29 экзоне гена С4А, обнаружен у одного ребенка с СКВ. Среди детской группы контроля ни один ребенок не имел этого дефекта.
Гетерозиготный дефицит гена С4В
Ни у кого из группы пациентов и групп контроля не было обнаружено точечной мутации (двунуклеотидной вставки в 29 экзоне) гена С4В.
Делеция C4AQ0
Рис. 1. Частота встречаемо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.