БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 5, с. 682 - 688
УДК 577.121.7
О ЛОКАЛЬНОМ СОПРЯЖЕНИИ СИСТЕМ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА И СИНТЕЗА АТФ В МИТОХОНДРИЯХ. ТЕОРИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТ
Обзор
© 2015 С.А. Еремеев*, Л.С. Ягужинский
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-0338, электронная почта: s.eremeev@gmail.com, yag@genebee.msu.su
Поступила в редакцию 25.12.14 После доработки 25.01.15
В работе дано краткое описание главных смысловых направлений поиска и изучения предложенной Р. Виль-ямсом модели локального сопряжения дыхания и фосфорилирования. В процессе поиска были найдены условия, при которых удалось выявить характерные функциональные особенности фосфорилирующей системы митохондрий, которые, в соответствии с теорией, должны наблюдаться в эксперименте в тех случаях, когда эта система работает в режиме суперкомплекса. Доказана возможность существования двух режимов работы фосфорилирующей системы: режима П. Митчелла и режима Р. Вильямса. Продемонстрирована способность АТФ-синтетазы (Б^о) использовать в реакции синтеза АТФ в качестве источника энергии термодинамический потенциал кислоты Бренстеда. Методом двойного титрования при работе фосфорилирующей системы в режиме суперкомплекса доказано существование жесткой стыковки электрон-транспортной системы и АТФ-синтетазного комплекса. На модели БЛМ сформирована модельная система химического синтеза фракции мембраносвязанных ионов водорода (кислот Бренстеда), обладающих избытком свободной энергии, и найдены катализаторы, которые избирательно ускоряют отрыв протонов, входящих в эту фракцию. Зарегистрировано формирование фракции кислот Бренстеда, обладающих избытком свободной энергии, при работе протонных помп на мембранах митопластов и митохондрий. В экспериментальной части работы приведено краткое описание результатов исследования свойств новых типов разобщителей, которые направленно переводят систему фосфорилирования из режима локального сопряжения в режим трансмембранного переноса протонов и, тем самым, достоверно ускоряют дыхание митохондрий и снижают величину параметра АДФ/О.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: локальное сопряжение; фосфорилирующая система митохондрий; мембраносвязанные протоны, обладающие избытком свободной энергии; разобщители, отключающие локальное сопряжение.
В 1961 г. были предложены две модели протонного сопряжения процессов дыхания и фосфорилирования митохондрий. Механизм П. Митчелла [1] в настоящее время считается общепринятым. В качестве начальной стадии трансформации энергии окислительных реакций он предполагает процесс индукции электрохимического потенциала ионов водорода на внутренней митохондриальной мембране, который осуществляется протонными помпами, путем трансмембранного переноса ионов водорода. Соглас-
Принятые сокращения: БЛМ — бислойная липид-ная мембрана; ТХФ-С15 — 2,4,6-трихлор-3-пентадецилфе-нол; 8кр3 — [10-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогексан-1,4-диен-1-ил)децил]трифенилфосфоний хлорид.
* Адресат для корреспонденции.
но этой модели, автономно-функционирующая АТФ-синтетазная система использует энергию мембранного потенциала для синтеза АТФ (Митчелл). Механизм локального сопряжения (Р. Вильямс) [2] предполагает прямой перенос энергии от дыхательных протонных помп к АТФ-синтетазе, протекающий с участием ионов водорода в составе мембранного суперкомплекса, включающего и Н+-помпы, и АТФ-синтетаз-ный комплекс.
В этой связи следует указать, что согласно Эйгену энергия полной сольватации протона в водной фазе составляет более 260 ккал/моль. Учитывая, что при синтезе одного моля АТФ запасается 7,3 ккал/моль [3], а на синтез одной молекулы АТФ расходуется 2,7—3,3 протона [4], можно заключить, что необходимая энергия для
синтеза АТФ может быть с огромным избытком запасена за счет энергии реакции частичной дегидратации протона. Модель Вильямса допускает такой механизм запасания энергии окислительных реакций, поскольку согласно этой модели при синтезе АТФ перенос энергии на АТФ-синтетазу осуществляется не «свободными», полностью гидратированными протонами, а связанными с мембранным суперкомплексом протонами — кислотами Бренстеда, которые хорошо экранированы от объема свободной водной фазы и поэтому могут переноситься на АТФ-синтетазу в частично дегидратированной форме.
Мы задались намерением проверить правильность гипотезы Вильямса. Для этого нам пришлось ответить на вопрос о том, насколько справедлива и модель Митчелла. После ряда неудачных попыток выполнить вторую, далеко не простую задачу, пришло решение, которое открыло путь к исследованию механизма локального сопряжения. Оказалось, что система окислительного фосфорилирования способна функционировать в двух формах — в диссоциированной форме, соответствующей модели Митчелла, и в форме суперкомплекса согласно модели Виль-ямса. В ходе этих исследований мы обнаружили, что при переходе к условиям низкоамплитудного набухания митохондрий при пониженной то-ничности среды инкубации (120 мОсм) функциональные параметры системы соответствуют режиму ее работы в форме суперкомплекса [5, 6].
ОБНАРУЖЕНИЕ ДВУХ РЕЖИМОВ
РАБОТЫ ФОСФОРИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ МИТОХОНДРИЙ
Изменения функциональных параметров фос-форилирующей системы митохондрий сопровождаются глубокой перестройкой ультраструктуры мембраны митохондрий, что было нами зарегистрировано на митохондриях с помощью электронной микроскопии [6], а также метода малоуглового рассеяния нейтронов на «живых» функционирующих митохондриях [7]. Кроме того, с помощью флуоресцентного зонда [6] были зарегистрированы сильно выраженные структурные изменения в белковой и липидной компонентах митохондриальной мембраны. При этом путем двойного ингибиторного анализа было показано, что в функционирующем суперкомплексе электрон-транспортная система ферментов и система синтеза АТФ жестко сопряжены друг с другом, так же как и элементы часового механизма, который прекращает свою работу при блокировке вращения любого элемента [5].
Итак, было установлено, что верными оказались оба варианта протонного сопряжения в фосфорилирующей системе. Это открытие позволило нам продолжить эксперименты, направленные на обнаружение и изучение условий образования и свойств мембраносвязанных ионов водорода, обладающих избытком свободной энергии (точнее, мембраносвязанных кислот Бренстеда). Опыты проводились как на митохондриях, так и в модельных системах.
В ходе этих исследований был проведен систематический поиск характерных функциональных признаков фосфорилирующей системы митохондрий, которые, в соответствии с теорией, должны наблюдаться в тех случаях, когда эта система работает в режиме суперкомплекса.
КИСЛОТЫ БРЕНСТЕДА КАК СУБСТРАТ АТФ-СИНТЕТАЗЫ
На начальном этапе исследования было найдено решение ключевого вопроса, связанного с переносом энергии на АТФ-синтетазу при работе системы в режиме суперкомплекса. Положительный ответ на вопрос о том, может ли АТФ-синтетаза использовать термодинамический потенциал кислот Бренстеда в качестве источника энергии, был получен на бинарной системе октан—вода, в которой АТФ-синтетаза (Р1Б0), выделенная из митохондрий сердца, сорбировалась на межфазной границе (со стороны водной фазы). В водную фазу этой системы добавлялись субстраты фосфорилирования. При этом в качестве источника энергии в реакции синтеза АТФ на межфазной границе использовался термодинамический потенциал кислоты Бренстеда (пентахлорфенола), которая добавлялась в гидрофобную фазу октана [8].
ФОРМИРОВАНИЕ ФРАКЦИИ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫХ ИОНОВ ВОДОРОДА, ОБЛАДАЮЩИХ ИЗБЫТКОМ СВОБОДНОЙ ЭНЕРГИИ, НА ПЛОСКОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЕ
Первая удачная попытка регистрации связывания протона с поверхностью мембраны при работе протонной помпы была описана Драче-вым с соавт. [9] на модели родопсиновых бляшек. Авторы обнаружили, что в реакции диссоциации мембраносвязанных кислот Бренстеда, образующихся при работе протонных помп, существует достаточно высокий кинетический барьер, способствующий удержанию протона на поверхности родопсиновых бляшек.
В нашей лаборатории на модели бислойной липидной мембраны (БЛМ) была разработана модельная система протонного транспорта [10, 11], в которой процесс трансмембранного переноса ионов водорода лимитирован реакцией отрыва протона от поверхности липидного би-слоя. При этом на транс-стороне БЛМ прямым методом было зарегистрировано образование фракции мембраносвязанных ионов водорода, обладающих избытком свободной энергии. Это согласуется с нашей гипотезой о возможности запасания энергии окислительных реакций в форме частично дегидратированных мембраносвязанных протонов (точнее, кислот Бренстеда) [12]. Полученные в этой работе результаты позволяют говорить о возможности протекания специфической реакции дегидратации кислот Бренстеда в процессе их переноса через гидрофобный барьер липидного бислоя.
О КАТАЛИЗАТОРАХ РЕАКЦИИ ДИССОЦИАЦИИ КИСЛОТ БРЕНСТЕДА, СВЯЗАННЫХ С ПОВЕРХНОСТЬЮ МЕМБРАН
Анализ результатов работы Антоненко с со-авт. [10] выявил необычное свойство слабых оснований — аниона лимонной кислоты (цитрата) и HEPES, которые обычно рассматриваются как рН-буферы. Однако в условиях экспериментов, проведенных на БЛМ, они проявили себя как катализаторы реакции отрыва мембраносвязан-ных ионов водорода, обладающих избытком свободной энергии, от поверхности мембраны. В условиях поддержания постоянного значения рН в среде повышение концентрации цитрата (или HEPES) снижает положительный поверхностный потенциал, индуцированный трансмембранным переносом протона в системе (потенциал измерялся методом компенсации внутреннего поля мембраны). Параллельно было показано, что слабые основания существенно усиливают скорость переноса протонов через бислой и тем самым, как показали прямые измерения, снижают рН в примембранном неперемешивае-мом слое. Последний эффект по знаку противоположен тому, который должен ожидаться в том случае, если цитрат функционирует в качестве буфера, поскольку повышение концентрации буфера должно снижать, а не повышать градиенты рН в системе. Таким образом, был продемонстрирован спе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.