БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 903 - 910
УДК 577.344
0 МЕХАНИЗМЕ ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННОГО ФОТООКИСЛЕННЫМ
ПСОРАЛЕНОМ
Мини-обзор
© 2015 Е.В. Невежин12, Н.В. Власова1, И.А. Пятницкий1, Е.П. Лысенко1, М.В. Малахов12*
1 Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ, кафедра физики и математики, 117997Москва; электронная почта: frost88.07@mail.ru
2 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ, отдел медицинской химии и токсикологии,
117997Москва; электронная почта: malakhov.mikhail@gmail.com
Поступила в редакцию 13.01.15 После доработки 16.03.15
Представлены современные данные о возможном механизме гемолиза эритроцитов, индуцированного фо-тоокисленным псораленом — медицинским фотосенсибилизатором фурокумаринового ряда. Гипотеза о ме-ханохимическом механизме гемолиза рассмотрена с учетом новых данных о фотоиндуцированной агрегации в растворах фотоокисленного псоралена. Обсуждается возможное химическое строение фотопродуктов-гемолизинов и агрегирующих фотопродуктов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: псорален, фотоокисленный псорален, фотопродукты, гемолиз эритроцитов, фото-индуцированная агрегация, химическая регуляция гемолиза.
Псоралены — трициклические УФ-фотосен-сибилизаторы растительного или синтетического происхождения, образованные в результате конденсации фурана и кумарина и успешно применяемые для лечения целого ряда патологий, обусловленных гиперреактивностью Т-кле-точного звена иммунитета (витилиго, псориаза, аллергического контактного дерматита и др.) [1]. Лечение может осуществляться посредством проведения ПУВА-терапии (транслитерация от англ. PUVA = psoralen + UV-A) [1] или фотофе-реза [2], при которых ПУВА-воздействию подвергаются кожа пациента или полученная от пациента лейкоцитарная масса соответственно. В настоящее время считается, что ПУВА-терапия реализуется за счет антипролиферативного и проапоптотического эффектов в отношении ке-
ратиноцитов и иммунокомпетентных клеток, а также вследствие индукции иммуносупрессии [1].
Серия проведенных в нашей лаборатории** исследований показала, что терапевтической эффективностью также обладает фотоокисленный псорален (ФОП), получаемый in vitro [3—5]. Этот факт заставил нас переосмыслить все существовавшие ранее представления о фотохимических механизмах, лежащих в основе ПУВА-терапии и фотофереза, сфокусировав свое внимание на исследованиях фотохимии и фотобиологии ФОП [6—9]. Ряд интересных эффектов, согласующихся с нашими результатами, был получен и другими исследователями [10—13]. ФОП представляет собой сложную смесь фотопродуктов псоралена, образующихся при фотоокислении его растворов, но лишь несколько фотопро-
Принятые сокращения: УФ — ультрафиолет; УФ-А — ближний ультрафиолет (315—400 нм); ПУВА — от англ. PUVA (псорален + УФ-А); ФОП — фотоокисленный псорален; НИ-ПУВА-гемолиз — низкоинтенсивный ПУВА-гемолиз (интенсивность УФ-А < 40 Вт/м2); ВИ-ПУВА-гемолиз — высокоинтенсивный ПУВА-гемолиз (интенсивность УФ-А > 120 Вт/м2); РСР — резонансное светорассеяние; GSH — восстановленная форма глутатиона; GSSG — окисленная форма глутатиона.
* Адресат для корреспонденции.
** В основе обзора лежат данные, полученные в лаборатории фотомедицины ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ, которую в течение 40 лет возглавлял профессор Александр Яковлевич Потапенко (1944—2014), светлой памяти которого посвящен этот обзор.
дуктов были химически охарактеризованы и протестированы в моделях in vitro и in vivo [14]. Это объясняется чрезвычайной сложностью разделения и химической идентификации отдельных фотопродуктов вследствие их малого выхода и нестабильности при проведении аналитических процедур [14—16]. По этой же причине исследование фотохимических закономерностей образования отдельных биологически активных фотопродуктов возможно лишь с использованием содержащей их сложной смеси.
Как ПУ В А-воздействие, так и обработка ФОП способны повреждать мембраны эритроцитов и индуцировать их гемолиз в разбавленной суспензии (107 кл/мл) [5, 17—24]. Эритроциты не являются мишенью ПУВА-терапии и фо-тофереза, а применяемые при их проведении концентрации псоралена приблизительно на два порядка ниже используемых в экспериментах по индукции гемолиза. Тем не менее модель гемолиза эритроцитов, индуцированного ПУВА-воздействием или обработкой ФОП, может служить простой и легко воспроизводимой моделью для изучения фотохимических механизмов образования биологически активных фотопродуктов, а также влияния ряда физико-химических факторов (интенсивность УФ-А-излу-чения, концентрация псоралена и др.) на их образование в ходе фотохимических реакций. Кроме того, исследования химической регуляции процесса гемолиза могут предоставить информацию о возможном химическом строении биологически активных фотопродуктов.
Далее мы рассмотрим современные представления о возможном механизме гемолиза эритроцитов, индуцированного ФОП, и предположительном химическом строении фотопродуктов-гемолизинов.
НИЗКОИНТЕНСИВНЫЙ ПУВА-ГЕМОЛИЗ (НИ-ПУВА-ГЕМОЛИЗ)
НИ-ПУВА-гемолиз индуцируется при воздействии на эритроциты УФ-А-излучением низкой интенсивности (интенсивность УФ-А < 40 Вт/м2) в присутствии псоралена и имеет те же черты и закономерности, что и другие виды фотогемолиза, например, УФ-гемолиз и гемолиз, индуцированный другими фотосенсибилизаторами [25]:
1) гемолизу подвергаются все клетки суспензии;
2) пороговая доза, т.е. доза, ниже которой гемолиз не индуцируется, отсутствует; 3) кривая гемолиза имеет сигмоидную форму; 4) скорость НИ-ПУВА-гемолиза прямо пропорциональна квадрату дозы облучения. НИ-ПУВА-гемолиз протекает по коллоидно-осмотическому меха-
низму (рис. 1), в процессе чего в мембране эритроцитов формируются каналы, проницаемые для катионов, но непроницаемые для крупных осмотически активных молекул (например, сахарозы) [19]. Отличительной особенностью НИ-ПУВА-гемолиза является его термоактивируемость, т.е. гемолиз индуцируется лишь в том случае, когда подвергнутые НИ-ПУВА-воздействию эритроциты затем инкубируют при 37°. Наиболее вероятной мишенью НИ-ПУВА-гемолиза считается белок полосы 3 анионного канала эритроцитов, состоящий из двух субъединиц и повреждаемый при воздействии на него целого ряда фотосенсибилизаторов [26, 27].
ВЫСОКОИНТЕНСИВНЫЙ ПУВА-ГЕМОЛИЗ (ВИ-ПУВА-ГЕМОЛИЗ)
При повышении интенсивности УФ-А-из-лучения характер гемолиза меняется, и при значениях интенсивности более 120 Вт/м2 наблюдаются черты, не характерные для НИ-ПУВА-гемолиза, а именно: 1) появляется пороговая доза облучения; 2) в узком диапазоне надпорого-вых доз наблюдается незавершенный гемолиз (в суспензии лизирует лишь некоторая доля клеток), и при дальнейшем повышении дозы гемолиз становится завершенным (в суспензии ли-зируют все клетки); 3) при увеличении дозы облучения скорость завершенного гемолиза парадоксально падает; 4) образующиеся в мембране каналы имеют размеры, большие размеров молекулы сахарозы [19]. Таким образом, механизм ВИ-ПУВА-гемолиза разительно отличается от коллоидно-осмотического и напоминает гемолиз, индуцируемый специфическими детергентами (например, дигитонином) [18]. Влияние температуры постлучевой инкубации на реализацию ВИ-ПУВА-гемолиза имеет сложный характер: при увеличении температуры дозовая зависимость сдвигается в сторону больших доз, при этом скорость гемолиза повышается. Это позволило предположить, что с увеличением температуры постлучевой инкубации количество каналов проницаемости уменьшается, хотя скорость гемолиза растет по причине снижения вязкости мембран и увеличения скорости латеральной диффузии, и, соответственно, увеличения скорости формирования крупных каналов проницаемости. С учетом вышеизложенного неслучайно, что для ПУВА-гемолиза не выполняется закон взаимозаменяемости интенсивности и длительности облучения [20]. В попытке объяснить различие между двумя типами ПУВА-гемолиза, было высказано предположение, что в индукцию ВИ-ПУВА-гемолиза значительный
Рис. 1. Основные типы гемолитического повреждения мембран эритроцитов, индуцируемого фотодинамическим воздействием (ПУВА-гемолиз) или фотоокисленным псораленом (ФОП-гемолиз)
вклад вносят продукты фотоокисления псорале-на (рис. 1), образующиеся и реализующие свою гемолитическую активность in situ в процессе ПУВА-воздействия [28].
ГЕМОЛИЗ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ
ФОТООКИСЛЕННЫМ ПСОРАЛЕНОМ (ФОП-ГЕМОЛИЗ)
Целая серия работ позволила установить, что описанные выше черты, характерные для ВИ-ПУВА-гемолиза, одинаково характерны и для ФОП-гемолиза [5, 21—24]. Особенно важным представляется тот факт, что образование ФОП-ге-молизинов возможно лишь в присутствии кислорода в растворе в процесе УФ-А облучения (рис. 1), т.е. ФОП-гемолизинами могут быть лишь продукты фотоокисления псоралена [21]. Кроме того, было выяснено, что образование ФОП-ге-молизинов происходит более эффективно при увеличении интенсивности УФ-А-излучения и/или концентрации псоралена в процессе получения ФОП [5]. Также было обнаружено, что растворы ФОП содержат несколько гемолизинов, различающихся по своей стабильности в процессе хранения при разных температурах (в диапазоне от 4 до 45°) и по своей гемолитической эффективности [23, 24, 29]. При этом ни один из обнаруженных эффектов не помог пониманию причины парадоксального снижения скорости гемолиза при увеличении дозы облучения.
Ранее нами был обнаружен факт гемолиза эритроцитов, который индуцируется широко используемым антиоксидантом ионолом (2,6-ди-трет-бутил-4-метил фенол ом) [30]. В высоких
концентрациях (16—100 мкМ) ионол способен индуцировать гемолиз эритроцитов, причем с увеличением его концентрации скорость гемолиза падала, как и в случае ФОП-гемолиза. В попытках объяснить феноменологическое сходство двух процессов была выдвинута гипотеза о механохимическом механизме гемолиза.
ГИПОТЕЗА О МЕХАНОХИМИЧЕСКОМ МЕХАНИЗМЕ ФОП-ГЕМОЛИЗА
Гипотеза предполагает, что образующиеся в процессе фотоокисления псоралена ФОП-гемо-лизины агрегируют в растворах, и именно агрегаты механически повреждают мембрану эритроцитов, вызыва
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.