БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 1036-1038
ДИСКУССИИ: -
УДК 577.15
О ВЛИЯНИИ а-ТОКОФЕР ОЛА НА АКТИВНО СТЬ ПРОТЕИНКИНАЗЫ С in vitro
© 2015 г. Н.Е. Краееова, С.В. Уграицкая, Н.В. Пеньков, Е.Е. Фесенко (мл.)
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3
E-mail: eugeny.ef@gmail.com Поступила в p едакцию 23.07.15 г.
Изучено влияние антиоксиданта а-токоферола на активность протеинкиназы C, выделенной из мозга крысы, как модельной системы для исследования бимодальной дозовой зависимости. Для измерения активности фермента применен фотометрический метод на основе люциферазной реакции с определением количества АДФ, образовавшегося в ходе реакции фосфорилирования. Исследование действия а-токоферола на активность протеинкиназы C in vitro выявило инги-бирующий эффект препарата в диапазоне концентраций 10—3—10—6 М, но не подтвердило наличие второго максимума биоэффекта при применении сверхмалых доз а-токоферола (10-12 М и ниже), что может быть связано с природой источника выделяемого фермента.
Ключевые слова: протеинкиназа C, а-токоферол, ингибитор, сверхмалые дозы, фотометрия, люциферазная реакция.
При изучении эффектов ряда биологически активных веществ было показано, что дозовая зависимость может иметь сложный характер: эффект, наблюдаемый в «обычном» концентрационном диапазоне действия вещества 10-3-10-7 М, сменяется «мертвой зоной», после чего вновь проявляется в области сверхмалых доз препа-рата (10-12 М и ниже). Дозовые зависимости такого типа получили название бимодальных. Бимодальные дозовые кривые описаны для значительного числа соединений [1]. Предложено несколько гипотез, объясняющих механизм действия сверхмалых доз препаратов, в том числе параметрического резонанса [2], взаимодействия каталитических центров в молекуле фермента [3], влияния градиента концентраций [4], наличия систем усиления сигнала [5]. Одна из гипотез связывает действие сверхмалых доз на биологический объект с изменением структурных свойств водного раствора [1,6]. В цикле работ, выполненных под руководством академика А.И. Коновалова, было установлено, что в высокоразбавленных водных растворах различных веществ наблюдается изменение комплекса физико-химических свойств, объясняемое возникновением стабильных супрамолеку-лярных структур - наноассоциатов [7-9]. При этом было показано, что наноассоциаты не образуются в «нулевом» магнитном поле [10]. Высказано предположение, что обр азование подобных супр амолекулярных структур может лежать в основе механизма бимодальной дозовой
зависимости [11]. Для того чтобы приблизиться к пониманию основ данного феномена, тр ебу-ется разр аботать высоковоспроизводимые биомодели с надежной регистрацией биоэффекта в области второго максимума. Такая модель в последующем позволила бы проводить исследование физико-химических свойств водных растворов действующих доз биологически активного вещества.
Задачей данной работы являлась разработка максимально стандартизованной биологической модели с бимодальным ха рактером дозовой зависимости на основе системы изолиро-ванный фермент-эффектор. C этой целью была выбрана система протеинкиназа C-а-токофе-рол, описанная в работе [12], со вторым максимумом биоэффекта - ингибирования проте-инкиназы C - в области концентраций а-токо-фер ола 10-15 М.
В экспериментальной работе использовали протеинкиназу C, выделенную из мозга крысы и очищенную по методу Вальтона [13], а также синтетический а-токоферол (кат. № T3251, чистота > 96%, Sigma, США). Очищенная пр оте-инкиназа С состояла преимущественно из а-, в- и у-изоформ с незначительными примесями 8- и Z-изо форм фермента. Протеинкиназа С и другие необходимые компоненты ферментативной реакции (пептидный субстрат, активатор фер мента, буфер) входили в состав коммерческого набора PKC Kinase Enzyme System (кат.
О ВЛИЯНИИ а-ТОКОФЕРОЛА НА АКТИВНОС ТЬ
1037
Зависимость интенсивности люминесценции от концентр ации ингибитор а а-токофер ола, добавленного в ферментативную реакцию протеинкиназы С. Интенсивность люминесценции пропорциональна количеству АДФ, обр азовавшемуся в ходе ферментативной р еакции и служащему индикатором активности пр отеинкиназы С. На гр афике отмечены ср едние значения и стандар тное отклонение, п = 5-15. Контр оли не пр иведены.
№ V4504, Promega, США). Навеску а-токофе-pола pастворяли в этиловом спирте с получением 0,1 М исходного р а створ а. Далее р а створ ы а-токофер ола готовили методом последовательного разбавления в 10 р аз исходного ра створ а свежепр иготовленной бидистиллир ованной водой с последующим встр яхиванием на шейкер е в течение 1 мин. В отдельных экспериментах пр и каждом р азведении р аствор а-токофер ола дополнительно инкубир овали 24 ч в закр ытом суховоздушном тер мостате пр и 20°С пер ед последующим разбавлением. Для измерения активности фер мента использовали коммер ческий набор для фотометрического определения количества АДФ, обр азовавшегося в ходе р еакции фосфорилирования (на основе использования люциферазной реакции) (кат. № V9101, ADP-Glo™ Kinase Assay, Promega, США). Pеакцию фо сфор илир ования и последующее детектир о -вание активности пр отеинкиназы С пр оводили в соответствии с рекомендованными протоколами пр оизводителя. Фотометр ию пр оводили на планшетном люминометр е GloMax@ 96 Мю-горЫе Luminometer (Promega, США). П р и пр о -ведении экспериментов ставили множественные контр оли (положительный контр оль без а-то-кофер ола, контр оли на люминесценцию отдельных компонентов р еакции, а также р аствор ов этилового спир та (р аствор ителя а-токофер ола) в различных разведениях вместо ингибитора).
П р оведенное исследование действия а-токо-фер ола на активность выделенной пр отеинкиназы С in vitro в диапазоне концентраций 10-310-18 М выявило ингибирующий эффект пре-пар ата в области 10-3-10-6 М (р и сунок). Активность пр отеинкиназы С увеличивалась по мер е снижения концентр ации а-токофер ола с 10-3 до
10-6 М, выходя затем на плато, соответствующее контр ольному ур овню активности фер мента в отсут ствие ингибито р а. Полученные р езультаты подтвер ждают данные о том, что а-токофер ол способен напрямую ингибировать протеинки-назу С, связываясь с одним из каталитических доменов фер мента [12,14]. До недавнего в р емени ряд исследователей придерживались мнения, что а-токофер ол опоср едованно ингибирует протеинкиназу С, реализуя свое влияние на клеточном ур овне чер ез активацию фо сфатазы РР2А [15,16].
В данной работе нам не удалось подтвердить наличие втор ого максимума биоэффекта пр и пр именении сверхмалых доз а-токофер ола 10-14-10-15 М. Можно предположить, что расхождение полученных результатов с данными работы [12] обусловлено более высокой степенью очистки используемого нами фермента и отсутствием в системе фер мент-эффекто р неучтенных факторов, обеспечивающих каскадный механизм усиления сигнала и, соответственно, второй максимум биоэффекта.
Вторая причина расхождений может быть связана с р азличием объектов, из котор ых выделяли фер мент. В базовой р аботе автор ы использовали протеинкиназу С из сердца кролика, которую выделяли сами. С огласно литер атур-ным данным в сердце кролика содержатся 10 индивидуальных изофер ментов: а, в1, в2, у, 8, 8, п, 0, Ц [17]. Каждая из этих изоформ могла вно сить свой вклад в общую активность пр отеинкиназы С. В описываемой же р аботе пр отеинкиназа С, выделенная из мозга кр ы сы, содержала только пять изоформ с преоблада-нием а, в и у и незначительной добавкой 8 и
1038
К РАССОВА и др.
Следует отметить, что в протеинкиназе С, выделенной из сердца кролика, изофор мы е и £ не являются минорными и играют существенную роль в функционировании сердечной мышцы. Таким образом, отсутствие второго максимума биоэффекта может быть обусловлено иным составом исследуемого фермента.
Прорыв в изучении эффектов сверхмалых доз вероятнее всего возможен при объединении двух научных направлений - физики водных растворов и биологии функционирования относительно простых и воспроизводимых биологических систем. Поиск таких систем будет продолжен.
Авторы благодарят проф. Н.П. Пальмину за ценные комментарии, сделанные при обсуждении р езультатов р аботы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН № 28 «П роблемы происхождения жизни и становления биосферы» (подпрограмма I, направление «Физика, химия и биология воды»).
СПИС ОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Е. Б. Бурлакова, А. А. Конрадов и Е. Л. Мальцева, Хим. физика 22 (2), 390 (2003).
2. А. Л. Блюменфельд, Биофизика 1, 129 (1993)
3. Е. Б. Бурлакова, А. А. Конрадов и И. В. Худяков, Изв. АН СССР. Сер. биол. 2, 184 (1990)
4. С. В. Зайцев, А. М. Ефанов и Л. А. Сазанов, Рос. хим. журн. XLIII (5), 28 (1999)
5. И. П. Ашмарин, Е. П. Каразеева и Т. В. Лелекова, Рос. хим. журн. XLIII (5), 21 (1999)
6. Н. П. Пальмина, В. В. Белов, В. Е. Жерновков и Е. Л. Мальцева, в кн.: Состояние воды в биологических и модельных системах (Тверь, 2007).
7. И. С. Рыжкина, Л. И. Муртазина, Ю. В. Киселева и А. И. Коновалов, Докл. РАН 428 (4), 487 (2009).
8. И. С. Рыжкина, Ю. В. Киселева, Л. И. Муртазина и др., Докл. РАН 447 (2), 179 (2012).
9. И. С. Рыжкина, Ю. В. Киселева, А. П. Тимошева и др., Докл. РАН 447 (1), 56 (2012).
10. И. С. Рыжкина, Л. И. Муртазина и А. И. Коновалов, Докл. РАН 440 (6), 778 (2011).
11. Н. П. Пальмина, Т. Е. Часовская, И. С. Рыжкина и др., Докл. РАН 429 (1), 128 (2009).
12. Н. П. Пальмина, Е. Л. Мальцева, Н. В. Курнакова и Е. Б. Бурлакова, Биохимия 59, 193 (1994).
13. G. M. Walton, H. Berttes, Р. J. Hudson, et al., Anal. Biodiem. 161, 425 (1987).
14. С. A. МсСагу, Y. Yoon, С. Panagabko, et al., Biodem. J. 441, 189 (2012).
15. R. R^dareln, A. Tasinato, S. dement, et al., Biodem. J. 334, 243 (1998).
16. A. Azzi and J. M. Zingg, Biodem. Mol. Biol. Edua 33 (3), 184 (2005).
17. Р. Ри^, H. Takano, J. Zhang, et al., Скс Res. 84 (5), 587 (1999).
On the Effect of a-Tocopherol on Protein Kinase C Activity in vitro
N.E. Krassova, S.V. Ugraitskaya, N.V. Penkov, and E.E. Fesenko Jr.
Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, ul. In
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.